论文部分内容阅读
胆管损伤后胆管的再生能力有限,修复术后往往伴随严重的胆道并发症。随着组织工程学的发展,以可降解材料为基础的半合成人工胆管的出现,为解决这一难题带来了新的希望。本研究运用半合成人工胆管补片和管型对胆管侧壁缺损和节段性缺损进行修复重建。通过观察比较空白胶原支架补片和管型及结合CBD-bFGF的胶原支架补片和管型对胆管上皮、腺体、微血管、平滑肌再生和瘢痕形成的影响,评价人工胆管材料对胆管缺损的修复效果和术后并发症的预防作用。第一部分：人工胆管补片修复猪胆管侧壁缺损的实验研究目的：探讨结合CBD-bFGF的胶原支架补片对猪胆管侧壁缺损的治疗作用。方法：体外实验：扫描电镜法检测材料孔径,液体置换法检测材料孔隙率,胆汁浸泡实验检测材料在胆汁中的体外降解速度。体内实验：中华实验用猪38只,分为三组：胶原支架/PBS组12只,胶原支架/CBD-bFGF组14只,正常对照组12只。胶原支架/PBS组和胶原支架/CBD-bFGF组制备胆管侧壁缺损后分别予空白胶原支架补片和结合CBD-bFGF的胶原支架补片进行修复,正常对照组不予任何处理,随前两组一同饲养,按期处死。术后4周、8周和12周,对实验动物进行肝功能和血常规检查。术后12周,对实验动物进行经胆囊胆管造影检查。术后4周、8周和12周处死的实验动物,先进行大体观察,再获取胆管进行爆破压测定。胆管修复区域经中性甲醛溶液固定后,石蜡切片行HE染色、Masson染色及免疫组化CK19、vWF、Desmin和a-SMA染色检查,对比评价修复效果。胶原支架/CBD-bFGF组的2只实验动物饲养至24周进行肝功能和血常规检查,并进行经胆囊胆道造影检查后,处死,再进行大体观察,最后获取胆管进行HE染色评价远期修复效果。结果：体外实验测得材料孔径为186.65±45.37μm,孔隙率为84.31士6.5%,材料在胆汁中3w左右降解。体内实验中胶原支架/PBS组和胶原支架/CBD-bFGF组的实验动物均健康存活至实验完成。虽然这两组实验动物的肝功能和血常规术后均在正常范围内,但是在术后4周、8周和12周,胶原支架/CBD-bFGF组的GGT和TBA指标均显著低于胶原支架/PBS组。术后8周和12周,胶原支架/CBD-bFGF组和胶原支架/PBS组的实验动物的新生胆管均能承受6KPa的爆破压。术后12周,这两组实验动物经胆囊胆道造影均未见狭窄和结石。Masson染色提示胶原支架/CBD-bFGF组的胶原结构比胶原支架/PBS组更规则,更接近于正常,并且胶原沉积量随时间呈下降趋势。免疫组化染色提示,胶原支架/CBD-bFGF组胆管上皮覆盖、腺体再生、微血管再生和平滑肌再生速度均显著快于胶原支架/PBS组,肌成纤维母细胞含量显著低于胶原支架/PBS组。术后4周,胶原支架/CBD-bFGF组的黏膜下腺体计数显著高于胶原支架/PBS组。相关性分析表明,胶原支架/PBS组、胶原支架/CBD-bFGF组和正常对照组在术后4周、8周和12周,胆管黏膜下腺体计数和MVD值之间均呈正相关。术后24w长期观察结果发现,胶原支架/CBD-bFGF组无狭窄及结石,胆管结构与正常胆管无差别。结论：1.采用胶原支架补片能完成长度为2cm,宽度为1/3-2/3胆管周径的胆管侧壁缺损的重建。2.结合CBD-bFGF的胶原支架补片能够显著地促进猪胆管侧壁缺损区域胆管上皮、腺体、微血管和平滑肌的再生,并降低胆管壁纤维性增厚引起胆管瘢痕性狭窄的风险。3.胆管黏膜下腺体计数和MVD值之间呈正相关,CBD-bFGF可能通过促进血管新生的方式促进胆管腺体的增生。第二部分：人工胆管管型修复猪胆管节段性缺损的实验研究目的：比较两种降解速度不同的胶原支架管型对猪胆管节段性缺损修复的影响；探讨结合CBD-bFGF的胶原支架管型对猪胆管节段性缺损的治疗作用。方法：体外实验：检测比较两种胶原支架的密度、孔径和孔隙率,以及在胆汁中的体外降解速度。其中胶原支架A为第一部分膜性修复研究采用的胶原支架,胶原支架B为在胶原支架A基础上改良的胶原支架。体内实验：中华实验用猪共35只,其中8只分为2组：胶原支架A组4只,胶原支架B组4只。胶原支架A组为采用胶原支架A构建的胶原支架管型替代胆管节段性缺损,胶原支架B组为采用胶原支架B构建的胶原支架管型替代胆管节段性缺损。观察4周内动物的一般情况、肝功能和血常规、HE染色,比较两种胶原支架管型对猪胆管节段性缺损修复的影响,并筛选出可供进一步研究的支架材料。其余27只分为3组：胶原支架/PBS组9只,胶原支架/CBD-bFGF组9只,正常对照组9只。胶原支架/PBS组和胶原支架/CBD-bFGF组分别采用筛选出来的空白胶原支架管型和结合CBD-bFGF的胶原支架管型替代胆管节段性缺损,正常对照组不予任何处理,随前两组一同饲养,按期处死。术后4周、8周和12周统计比较术后并发症的发生情况,并对实验动物进行肝功能和血常规检查。术后12周对实验动物进行经胆囊胆道造影检查。所有实验动物处死后行大体观察,获取胆管予中性甲醛固定后,石蜡切片行HE染色、Masson染色及免疫组化CK19、Ki67、vWF、 Desmin和a-SMA染色,对比评价修复效果。结果：通过体外实验测得胶原支架B材料的密度显著高于胶原支架A,但两种材料的孔径和孔隙率无差异。胆汁浸泡实验表明胶原支架B较胶原支架A在胆汁中的体外降解速度明显减缓。动物实验结果提示术后4w内,胶原支架A组的实验动物因胆漏、感染和营养不良等原因全部死亡,而胶原支架B组全部存活至观察的时间点,因此胶原支架B更适合用于进一步研究。结合CBD-bFGF的胶原支架B管型动物实验结果：术后并发症统计结果表明,胶原支架/CBD-bFGF组胆道梗阻的发生率显著低于胶原支架/PBS组,但两组死亡率、胆道感染发生率相比差异无统计学意义。肝功能和血常规提示：术后4周和8周,胶原支架/CBD-bFGF组部分实验动物出现了修复区域材料发生塌陷,继发了胆管狭窄和胆管感染导致肝功能受损,营养不良等情况；但是存活至术后12周的实验动物中,胶原支架/CBD-bFGF组的感染情况和肝功能受损情况较胶原支架/PBS组明显减轻,营养状况较胶原支架/PBS组明显改善。术后12周经胆囊胆道造影结果表明,胶原支架/CBD-bFGF组未出现明显胆道狭窄；胶原支架/PBS组则提示肝内外胆管显著扩张,胆管远端狭窄。HE染色提示,胶原支架/CBD-bFGF组瘢痕大小和胆管厚度均显著低于胶原支架/PBS组。Masson染色提示,胶原支架/CBD-bFGF组的胶原结构比胶原支架/PBS组更规则,更接近于正常；而胶原支架/PBS组则见大量的炎性细胞浸润。免疫组化染色结果提示,胶原支架/CBD-bFGF组胆管上皮覆盖、腺体再生、微血管再生和平滑肌再生速度均显著快于胶原支架/PBS组,肌成纤维母细胞含量显著低于胶原支架/PBS组。结论：1.采用改良过的空白胶原支架管型修复长度为2cm的胆管节段性缺损,仅能完成瘢痕性修复,无法预防胆管狭窄的发生。2.与改良过的空白胶原支架管型相比,结合CBD-bFGF的胶原支架管型能够显著地促进猪胆管节段性缺损胆管结构的再生,并降低了肌成纤维母细胞的含量,但存在材料降解速度和胆管再生速度不匹配,材料塌陷的风险。有进一步改进的空间。