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研究背景:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常见的淋巴系统肿瘤,占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)的30-40%,是其最常见的一种亚型。DLBCL是一种异质性很大的侵袭性恶性肿瘤,包括在组织形态学、细胞遗传学、分子生物学及临床预后方面。近年来,基于含有利妥昔单抗(rituximab)的联合化疗 R-CHOP(rituximab,cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine,prednisolone)方案,DLBCL患者的治疗效果显著提高,生存期也明显延长。然而在R-CHOP的治疗下,仍有近1/3的难治复发患者,且只有很少的患者得益于挽救治疗及自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)。那么新的药物对于治疗DLBCL是迫切需要的,目前靶向药物一直是恶性肿瘤研究的热点。血管生成对肿瘤生长及转移至关重要,选择性的抑制血管生成已成为抗肿瘤治疗的策略,目前越来越多的靶向血管生成药物在临床上运用于肿瘤。Apatinib是一种靶向血管的抑制剂,为血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)酪氨酸激酶抑制剂;Apatinb能强效抑制肿瘤血管生成,主要作用机制是竞争性结合该受体胞内酪氨酸ATP结合位点,高度选择性地抑制VEGFR2酪氨酸激酶活性,阻断VEGFR2与内皮生长因子(VEGF)结合后的信号传导。VEGF与VEGFR2结合后可以激活多种信号通路,包括PI3K/Akt、Ras通路等,而Ras通路与人类绝大多数肿瘤密切相关,也是VEGF/VEGFR2激活后重要的信号途径。Apatinib作用于VEGFR2后,可以抑制VEGF/VEGFR2的激活,从而抑制其激活Ras信号通路,发挥抗肿瘤效应。研究目的:探讨Apatinib能否抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖并诱导其凋亡,并进一步研究其杀伤作用与Ras信号通路的关系,为开拓弥漫大B细胞淋巴瘤治疗新方法提供实验依据。研究方法:1、用 CCK-8 法检测不同浓度的(2.5、5、10、20、40μmol/L)Apatinib 作用48h后对DLBCL细胞株的增殖抑制作用。2、用Annexin-V/PI双染法流式细胞术检测不同浓度的(0、10、20、30、40μmol/L)Apatinb处理48h后对DLBCL细胞株凋亡的影响。3、利用蛋白免疫印迹法检测Apatinib作用oci-ly1和细胞SU-DHL-2 48h后pVEGFR2蛋白及Ras信号通路中Ras、c-Raf、pMEK1/2和pErK1/2的表达变化。4、统计学分析采用SPSS19.0软件,由于均是小样本数据的统计,两组独立样本均数的比较采用非参数检验(Mann-WhitheyU检验);多组间均数比较采用多个独立样本的非参数检验(Kruskal-WallisH检验)。计量资料用Mean±SD表示,所有的检验分析均是双侧检验,检验水准为α=0.05。研究结果:1.CCK8 结果显示:Apatinib 对 GCB 型 DLBCL 细胞株 oci-ly1、SU-DHL-4(S4)及ABC细胞株oci-ly3、SU-DHL-2(S2)具有明显的增殖抑制作用,并呈剂量依赖性。Apatinib 作用 oci-ly1、SU-DHL-4(S4)oci-ly3、SU-DHL-2(S2)细胞 48h 后,其 IC50 分别为(19.30±0.07)μmol/L、(18.15±0.15)μmol/L、(18.15±0.15)μmol/L、(15.29±0.13)μmol/L 和(12.34±0.27)μmol/L,经多个独立样本的非参数检验Kruskal-Wallis H检验分析结果表明与对照组比较差异均具有统计学意义(χ2=16.460,P=0.006;χ2=16.248,P=0.006;χ2=16.460,P=0.006 和χ2=16.648,P=0.005)。经两个独立样本非参数检验Mann-Whitney U分析,ABC型细胞株oci-ly3的增殖抑制率分别明显高于两种GCB型细胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)(P=0.047和P=0.047);同样,另一株ABC型细胞株SU-DHL-2的增殖抑制率分别高于两种 GCB 型细胞株 oci-ly1 和 SU-DHL-4(S4)(P=0.047 和 P=0.047)。2.Annexin V/PI双染法流式细胞术检测Apatinib作用于GCB型DLBCL细胞株 oci-ly1、SU-DHL-4(S4)及 ABC 型细胞株 oci-ly3,SU-DHL-2(S2)48h 后的凋亡比例,发现 Apatinib 能够诱导 oci-ly1、SU-DHL-4(S4)、oci-ly3、SU-DHL-2(S2)细胞凋亡,呈浓度依赖性,经多个独立样本的非参数检验Kruskal-WallisH检验分析,与对照组比较差异均具有统计学意义(χ2=12.767,P=0.012;χ2=13.233,P=0.010;χ2=13.033,P=0.011 和χ2=12.933,P=0.012)。两种类型DLBCL细胞株的凋亡率的比较无统计学意义,经两个独立样本非参数检验Mann-Whitney U分析,ABC型细胞株oci-ly3的凋亡率与两种GCB型细胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)比较均无明显差异(P=0.275和P=0.06);同样,另一株ABC型细胞株SU-DHL-2的凋亡率与GCB型细胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)比较均无统计学意义(P=0.275和P=0.06)。3.蛋白质印迹法结果显示Apatinib可通过抑制VEGFR2的自磷酸化即抑制pVEGFR2蛋白的表达,进而抑制Ras(Ras、Raf、pMEK1/2、pErk1/2)信号通路。对蛋白条带进行灰度分析,经多个独立样本非参数检验Kruskal-Wallis H检验,Apatinib 组(20、40μmnol/L)中 pVEGFR2、Ras、c-Raf、pMEK1/2,pErk1/2 蛋白表达水平与对照组(0μmol/L)相比,差异均具有统计学意义(均χ2=7.2,均P=0.027)结论:1.不同浓度的Apatinib能抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞oci-ly1、SU-DHL-4(S4)、oci-ly3、SU-DHL-4(S2)的增殖,并诱导其凋亡。且 Apatinib 对于ABC型的DLBCL细胞株的增殖抑制率效果更明显。2.Apatinib通过抑制VEGF与VEGFR2的结合,阻止VEGFR2发生自磷酸化成pVEGFR2而活化,从而抑制其激活的Ras信号通路,发挥杀伤弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的作用。