焦虑症(anxiety disorder)是一种常见的精神类疾病,通常是由预先知道的但又不可避免以及行将发生的恶性事件引发的一种预期反应,以恐惧、忧虑、紧张不安等精神障碍为主要表现,并经常伴有心悸、多汗、呼吸窘迫、手脚发凉等植物神经功能紊乱的症状。在我国,焦虑症已成为现代常见病和多发病,严重影响了人们的生活质量。目前,国内在精神疾病治疗领域缺乏有效的中成药品种,通过国家食品药品监督管理局批准治疗焦虑症的纯中药制剂,只有九味镇心颗粒一种;焦虑的产生与多种行为反应(如惊厥、冲动、攻击和药物依赖)有关,可能是由多基因调控的,目前对其病理机制尚未彻底阐明。因此,对抗焦虑中成药的开发与机制研究很有必要。复方抗焦虑胶囊组方为临床有效方剂马蹄香抗焦虑复方,是由马蹄香(又名蜘蛛香Rhizoma Valeriana Jatamansi),合欢皮(Cortex Albizia),炒酸枣仁(the parched Semen Ziziphi Spinosae),灯心草(Medulla Junci)四味药组成。治则为疏肝解郁,养血安神,对于治疗肝气郁结、心神不宁型焦虑症有显著疗效。课题组前期以地西泮为阳性药展开复方抗焦虑胶囊的药效学和机制探讨研究,表明其具有稳定的抗焦虑作用。复方抗焦虑胶囊疏肝解郁,养血安神,主要适用于肝郁气滞、心神不宁型焦虑症,其作用机制与调节GABA转导效应;调节Cdk5/p35通路的表达;抑制脑组织中5-HT、NE等单胺类神经递质的释放以及调节免疫功能紊乱相关。九味镇心颗粒主要适用于心脾两虚型焦虑症。那么,复方抗焦虑胶囊与九味镇心颗粒相比,抗焦虑药效如何?复方抗焦虑胶囊的作用机制除上述之外,还与哪些信号通路相关?这些问题很值得我们研究。本课题针对课题组前期制备复方抗焦虑胶囊,通过小鼠与大鼠行为学实验进一步系统地比较其与唯一市售抗焦虑纯中药制剂一九味镇心颗粒的药效,探讨复方抗焦虑胶囊对急性应激大鼠脑皮层及海马BDNF表达的影响;对ERK/CREB通路的影响;对急性应激大鼠脑组织第三信使c-fos表达的影响。通过以上研究,为复方抗焦虑胶囊其安全有效的应用提供实验和理论的依据,同时,为复方抗焦虑胶囊的临床前研究奠定良好的基础,也为中医治疗焦虑症开发新的治疗途径起到了良好的示范作用。主要研究内容及结果如下:1药效学研究1.1小鼠药效学实验研究采用高架十字迷宫实验(EPM)、明暗箱实验(LDB)、旷场实验(OFT)和自主活动实验比较评价了复方抗焦虑胶囊与九味镇心颗粒的抗焦虑作用。小鼠高架十字迷宫实验表明复方抗焦虑胶囊的剂量为4.8g/kg/d时,在不提高动物的活动性前提下,可以显著增加进入开臂时间和次数百分比,有稳定可靠的抗焦虑作用,九味镇心颗粒只可以提高小鼠的开臂时间百分比。明暗箱实验结果显示,与对照组相比,复方抗焦虑胶囊剂量为4.8g/kg/d时,可显著增加小鼠在明箱中的时间与在明箱中的活动次数。旷场实验结果表明,复方抗焦虑胶囊剂量为2.4g/kg/d时,可显著增加小鼠进入中央区的次数,表现出抗焦虑作用。自主活动实验结果表明,复方抗焦虑胶囊和九味镇心颗粒在产生抗焦虑药效作用的剂量下没有增加小鼠自主活动性,对小鼠的自主活动能力无影响。1.2大鼠药效学实验研究采用高架十字迷宫实验(EPM)、旷场实验、Vogel饮水冲突实验和急性应激后高架十字迷宫实验比较评价了复方抗焦虑胶囊和九味镇心颗粒的抗焦虑作用。大鼠高架十字迷宫实验表明复方抗焦虑胶囊中剂量组、高剂量组,九味镇心颗粒组在不提高动物活动性的前提下,能显著增加大鼠进入开臂时间和次数百分比，具有稳定可靠的抗焦虑作用。Vogel饮水冲突实验结果显示,与对照组相比,复方抗焦虑胶囊的不同剂量组与九味镇心颗粒均可显著增加电击情况下大鼠的饮水次数。旷场实验结果表明复方抗焦虑胶囊中剂量组、九味镇心颗粒组可显著增加大鼠在旷场中央区停留的时间;同时,地西泮组、复方抗焦虑胶囊高剂量组可显著增加大鼠进入中央区的次数。大鼠急性应激后高架十字迷宫实验表明动物在给予应激束缚后,在高架十字迷宫模型上表现出焦虑,在开臂的探索活动明显受到抑制,而复方抗焦虑胶囊显著提高了大鼠进入开臂的时间和次数,产生了抗焦虑作用,九味镇心颗粒在此模型上则没有显示出抗焦虑作用。2机制探讨2.1复方抗焦虑胶囊对急性应激大鼠海马及皮层ERK/CREB通路的影响通过蛋白印迹法检测了复方抗焦虑胶囊对急性应激大鼠的胞外信号调节蛋白激酶(ERK)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)信号通路磷酸化水平变化,结果证明,与空白组相比,模型组的p-ERK与p-CREB水平显著升高,与模型组相比,复方抗焦虑胶囊高剂量组可显著减少大鼠海马和皮层中p-ERK与p-CREB的表达水平。提示复方抗焦虑胶囊的抗焦虑作用可能通过调节ERK/CREB通路,发挥其抗焦虑作用。2.2复方抗焦虑胶囊对急性应激大鼠海马和皮层BDNF蛋白表达的影响通过蛋白印迹测定法检测了复方抗焦虑胶囊对急性应激大鼠海马和皮层BDNF蛋白表达的影响，结果显示,与空白组相比,模型组的BDNF表达水平显著下降,与模型组相比,地西泮组、复方抗焦虑胶囊高剂量组均使大鼠的BDNF表达水平显著上升,这表明,BDNF蛋白参与急性焦虑信号,复方抗焦虑胶囊可通过调节BDNF产生抗焦虑作用。此外,文献报道,ERK-CREB通路与BDNF蛋白的表达关系密切,ERK-CREB通路的变化可以影响BDNF蛋白含量的表达,而实验结果表明复方抗焦虑胶囊对ERK-CREB通路和BDNF蛋白的表达都有显著的影响,因此提示胶囊也可能通过调节它们的相互反应而发挥其抗焦虑作用。2.3复方抗焦虑胶囊对急性应激大鼠脑组织第三信使c-fos表达的影响通过免疫组化测定法检测复方抗焦虑胶囊对急性束缚应激大鼠下丘脑中c-fos表达的影响,这也是从第三信使的角度深入探讨其抗焦虑的机制。研究结果显示,与对照组相比,模型组大鼠c-fos表达的阳性细胞数及总光密度值明显上升(P<0.05)。证实了束缚应激可以诱导下丘脑室旁核c-fos的表达,下丘脑参与了应激的调控。而与模型组相比,地西泮组及复方抗焦虑胶囊高剂量组均使c-fos表达的阳性细胞数及总光密度值明显下降(P<0.05)。提示降低下丘脑室旁核c-fos表达可能为复方抗焦虑胶囊抗焦虑作用机制之一。3结论采用小鼠高架十字迷宫实验(EPM)、明暗箱实验(LDB)、旷场实验(OFT)和自主活动实验,大鼠高架十字迷宫、Vogel饮水冲突、旷场和束缚应激实验,从非条件反射模型和条件反射型惩罚性模型等不同角度比较评价了复方抗焦虑胶囊与九味镇心颗粒的抗焦虑作用,增加了药效学评价的全面性和可靠性。通过对复方抗焦虑胶囊的机制研究表明其发挥抗焦虑作用主要通过调节大鼠脑组织ERK-CREB通路;影响BDNF的表达;减少脑组织第三信使c-fos表达来实现的。通过对本课题的研究,为后续的复方抗焦虑胶囊的“新药临床研究”奠定一定的实验基础,并为中药复方制剂抗焦虑药效和机制的系统深入研究提供了思路。