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目的：DNA疫苗因既能诱导体液免疫应答，又能诱导细胞免疫应答而受到广泛关注，但作为治疗性疫苗其免疫效果尚需进一步提高。粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一个具有多项潜能的造血生长因子，不仅能刺激造血祖细胞增殖、分化和成熟并从骨髓向外周转移，而且还能活化中性粒细胞、巨噬细胞、DC及其他单核细胞（23），在细胞因子网络中占有重要地位，在免疫反应中具有重要作用。本课题将GM-CSF基因与乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因融合，构建融合乙型肝炎DNA疫苗，旨在借助GM-CSF的免疫佐剂作用，通过基因融合技术提高乙型肝炎DNA疫苗的免疫效果，为进一步探索乙型肝炎治疗性疫苗和融合蛋白疫苗打下基础。方法：（1） 用PCR方法和基因克隆技术，构建pcDNA3.1-S、pcDNA3.1-GM-CSF、pcDNA3.1-S-GM-CSF和 pcDNA3.1-GM-CSF-S真核表达质粒，分别用酶切和DNA测序进行鉴定；以上述构建的质粒转染HepG2细胞和COS-7细胞，用ELISA方<WP=9>（2） 法检测转染细胞培养上清及细胞裂解液中HBsAg的表达；用免疫细胞化学的方法检测质粒转染细胞中GM-CSF的表达。用SDA－PAGE及Western Bloting鉴定融合基因的表达。（3） 以重组质粒DNA免疫BALB/C小鼠，用ELISA方法检测质粒诱导BALB/C小鼠产生抗-HBs及脾细胞经HBsAg体外刺激后分泌IL-2、IL-4及IFN-γ的水平；并用51Cr法检测HBsAg特异性CTL反应。（4） 以重组质粒DNA免疫HBV转基因小鼠，用ELISA方法检测质粒免疫后，HBV转基因小鼠HBsAg表达水平及脾细胞经HBsAg体外刺激后分泌IL-2、IL-4及IFN-γ的水平；用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖；用免疫组织化学的方法检测肝细胞HBsAg的表达；肝组织切片经HE染色后，进行肝组织学检查。结果：（1） 经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒pcDNA3.1-S、pcDNA3.1-GM-CSF、pcDNA3.1-S-GM-CSF和 pcDNA3.1-GM-CSF-S构建正确。（2） 重组质粒DNA转染HepG2细胞和COS-7细胞，pcDNA3.1-S 转染细胞培养上清及裂解液中HBsAg均为阳性， pcDNA3.1-GM-CSF-S转染细胞裂解液中HBsAg为阳性，而pcDNA3.1-S-GM-CSF及pcDNA3.1-GM-CSF转染细胞培养上清及细胞裂解液HBsAg均为阴性，对照质粒pcDNA3.1转染的细胞培养上清及细胞裂解液HBsAg为阴性。<WP=10>（3） 免疫细胞化学的方法检测发现在pcDNA3.1-GM-CSF和 pcDNA3.1-GM-CSF-S转染细胞的胞浆内有大量黄棕色的阳性颗粒，说明pcDNA3.1-GM-CSF和pcDNA3.1- GM-CSF-S转染的COS-7细胞内有GM-CSF表达，在pcDNA3.1-S-GM-CSF和 pcDNA3.1转染的细胞内没有黄棕色颗粒，说明没有相应的蛋白表达。（4） SDA－PAGE检测，pcDNA3.1-GM-CSF-S、pcDNA3.1-GM-CSF 和pcDNA3.1-S 转染细胞的细胞裂解液所在泳道约46KD、22KD及24KD处可见蛋白浓染带，pcDNA3.1-S-GM-CSF转染细胞细胞裂解液所在泳道无相应蛋白浓染带，所有质粒转染细胞培养上清所在泳道均未见相应蛋白浓染带。经Western Blot鉴定，重组质粒转染细胞裂解液及培养上清均未见抗原特征条带，可能与样本中表达蛋白浓度较低有关。 （5） 质粒DNA初次免疫BaLB/C小鼠4周后，PcDNA3.1-S、PcDNA3.1-GM-CSF-S和乙肝疫苗组血清抗-HBS为阳性。加强免疫四周后，PcDNA3.1-S 、PcDNA3.1-GM-CSF-S 、PcDNA3.1-S＋PcDNA3.1-GM-CSF-S和乙肝疫苗组抗体滴度明显升高，其中PcDNA3.1-GM-CSF-S 和乙肝疫苗组抗体滴度显著高于其余各实验组（P<0.05 ﹚；对照组PcDNA3.1和PBS为阴性。质粒DNA免疫BALB/C小鼠，PcDNA3.1-S、PcDNA3.1-GM-CSF-S及PcDNA3.1-S+ PcDNA3.1-GM-CSF组能诱导出较强的HBsAg特异性CTL反应，与其他各实验组相比具有统计学意义（p<0.05）；<WP=11>（6） 其中PcDNA3.1-GM-CSF-S免疫组所诱导的HBsAg特异性CTL反应最强，显著强于PcDNA3.1-S及PcDNA3.1-S+ PcDNA3.1-GM-CSF免疫组（p<0.05），空质粒PcDNA3.1和PBS对照组未检测到HBsAg特异性CTL反应。（7） 质粒DNA免疫BALB/C小鼠，8周后，检测脾细胞经体外HBsAg刺激后分泌细胞因子的水平。pcDNA3.1-S 、pcDNA3.1-GM-CSF-S及pcDNA3.1-S+ pcDNA3.1-GM-CSF组IL-2及IFN-γ的分泌水平显著高于其它各组（P<0.05），其中pcDNA3.1-GM-CSF-S 组分泌水平最高，其分泌水平显著高于pcDNA3.1-S 及pcDNA3.1-S+ pcDNA3.1-GM-CSF组(P<0.05)， PBS组未检测到IL-2分泌。实验组和对照组均未检测到IL-4的分泌。（8） 质粒DNA免疫HBV转基因小鼠前，各实验组小鼠血清HBsAg表达水平无显著差异(P>0.05)，表明各实验组均衡性好，组间具有可比性。初次免疫4周后，PcDNA3.1-S 、PcDNA3.1-GM-CSF-S 及PcDNA3.1-S＋PcDNA3.1-GM-CSF组血清HBsAg滴度较质粒DNA免疫前显著下降（P<0.05）， 并显著低于PBS对照组（P<0.05）。加强免疫四周后，PcDNA3.1-GM-CSF-S 、PcDNA3.1-S＋PcDNA3.1-GM-CSF及 PcDNA3.1-S组血清HBsAg滴度进一步下降，并显著低于PcDNA3.1及PBS对照组（P<0.05），其中PcDNA3.1-GM-CSF-S组血清HBsAg滴度显著低于PcDNA3.1-S组（P<0.05）。<WP=12>（9） 质粒DNA免疫HBV转基因小鼠，检测脾细胞经体外HBsAg刺激后分泌细胞因子的水平。pcDNA3.1-S 、pcDNA3.1-GM-CSF-S及pcDNA3.1-S+ pcDN