【摘 要】
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本试验旨在研究西门塔尔牛表皮干细胞（epidermal stem cells,Ep SCs）的分离培养与鉴定,探讨其体外诱导分化潜能,并研究其对小鼠烫伤模型的治疗效果。取3～4月龄的西门塔尔牛表皮,采用酶消化法和组织贴壁法分离得到西门塔尔牛Ep SCs并进行体外连续的传代培养及冷冻保存。通过克隆形成能力检测和绘制生长曲线探讨西门塔尔牛Ep SCs增殖能力,通过划痕实验检测Ep SCs细胞迁移能力。
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本试验旨在研究西门塔尔牛表皮干细胞（epidermal stem cells,Ep SCs）的分离培养与鉴定,探讨其体外诱导分化潜能,并研究其对小鼠烫伤模型的治疗效果。取3～4月龄的西门塔尔牛表皮,采用酶消化法和组织贴壁法分离得到西门塔尔牛Ep SCs并进行体外连续的传代培养及冷冻保存。通过克隆形成能力检测和绘制生长曲线探讨西门塔尔牛Ep SCs增殖能力,通过划痕实验检测Ep SCs细胞迁移能力。通过免疫荧光鉴定Ep SCs表面标记物（ITGβ1、P63和CD71）,通过RT-PCR对Ep SCs特异性基因（ITGβ1、KRT19和ITGα6）进行表达分析。并对西门塔尔牛Ep SCs进行体外成脂、成骨和软骨诱导分化,检测其多向分化潜能。利用100℃开水烫伤ICR品系小鼠表皮,制作小鼠Ⅱ度烫伤模型,表皮烫伤1 d后通过细胞移植将Ep SCs皮下注射至表皮损伤部位。取小鼠表皮,通过观察HE病理切片分析表皮损伤修复状况,同时对表皮中移植的干细胞进行定位。在分子水平采用ELISA的方法对小鼠的IL-6和TNF-α炎症因子进行检测。结果表明,组织块贴壁法获得的Ep SCs纯度较低,酶消法获得的Ep SCs纯度较高。Ep SCs细胞生长曲线呈“S”型,细胞的群体倍增时间平均为32.64 h。免疫荧光结果显示Ep SCs表面特异性标记物ITGβ1、P63和CD71呈阳性表达,RT-PCR结果显示Ep SCs高度表达ITGβ1、KRT19和ITGα6,不表达CD31基因。Ep SCs在体外可诱导分化为脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞。诱导分化的脂肪细胞可产生大量折光性较强的脂滴,经油红O染色呈深红色,且阳性表达PPAR-γ和LPL。诱导分化的成骨细胞可形成大量钙结节,经茜素红染色的钙沉积物呈橙红色,具有一定厚度,且细胞阳性表达CollagenⅠ和RUNX2基因。诱导分化的软骨细胞可形成被阿利新蓝染色的软骨基质,且阳性表达BGN和CollagenⅡ。Ep SCs细胞移植治疗小鼠烫伤结果显示,Ep SCs可以促进表皮及毛囊等结构的修复,其可能通过Ep SCs的增殖及其外泌体刺激周围细胞增殖促进皮肤的修复。同时,Ep SCs具有抑制IL-6和TNF-α炎症因子的作用。该研究成功从西门塔尔胎牛表皮中分离出生长状态良好的西门塔尔牛Ep SCs,且具有向成骨,软骨和脂肪细胞等多向分化潜能,建立了西门塔尔Ep SCs细胞系及其体外分离培养体系。Ep SCs可促进小鼠皮肤损伤修复,具有较好的抑制炎症作用。
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