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背景与目的:龋病是一种危害人类健康的的全球性疾病。自从病因学研究证实龋病为一种细菌感染性疾病以来,人们就有关龋病的相关微生物及免疫学方面的课题做了深入的研究。大量的证据表明变异链球菌(Streptococcus mutns,变链菌)与龋病的发生、发展密切相关,是目前公认的主要致龋菌,而与其致病相关的抗原成分已被用于免疫防龋的开发和研究。变链菌在牙面的粘附和聚集是其在口腔定植和致病的前提和基础。与此相关的毒力因子,如表面粘附分子Agl/Ⅱ(PAc)和葡糖基转移酶(GTF)在此过程中起到了关键性的作用。首先,变链菌在牙面的附着有赖于PAc的功能结构域—唾液结合区段(Saliva-binding region,SBR);而在牙面的聚集和菌斑的形成有赖于GTF合成的不溶性葡聚糖(变聚糖)。实验表明针对PAc和GTF功能域(即唾液结合区域SBR和葡聚糖结合区域GBR)的抗体能有效阻止变链菌在牙面的定植。在前期的研究中我们已经成功地克隆出了编码SBR和GBR的基因片段sbr和gbr,并构建了包含有sbr或/和gbr的多种DNA质粒,本实验为探求提高免疫效能的免疫方法,采用了含有CMV和nirB的双启动子表达质粒pCMVnir,并利用减毒沙门氏菌SL3261作为载体进行肠道粘膜免疫,以期获得满意的免疫效果。本研究中我们首先通过DNA疫苗的体外表达我们验证了双启动子CMV和nirB在原核载体SL3261和真核细胞中调控抗原表达的功效。然后通过胃肠粘膜免疫我们在BALB/c小鼠身上探索了双启动子DNA疫苗pCN-SS/SG的免疫原性,和其诱导的免疫反应,并且通过动物实验评价了其作为防龋疫苗对变链菌的抗定植作用。方法:第一部分:沙门菌运载的粘膜疫苗pCN-SS/SG在小鼠体内诱导的免疫反应1.使用前期构建的 pTriEx-4-SBR 和 pTriEx-4-GBR 质粒在 JM109(DE3)大肠杆菌表达体系中诱导表达SBR和GBR,并用HisTrap TM试剂盒加以纯化来免疫BALB/c小鼠以制备抗SBR和GBR的多克隆抗体。2.利用前期研究中构建的质粒pCN-SS/SG和pCN-SSIE分别转化减毒沙门氏菌SL3261,和转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,并培养其转化株。3.将转染后的CHO细胞培养48小时,SL3261转化株在无氧条件下过夜培养,利用荧光显微镜和Western blot检测目的基因的表达情况。4.将pCN-SS/SG转化的SL3261于体外无抗生素的培养基中连续培养5天;并用SL3261/pCN-SS/SG 口服免疫小鼠,于免疫后的不同时间点检测小鼠肝脏、脾脏、小肠PP结中沙门菌的定植情况,以及质粒pCN-SS/SG体内、外的稳定性。5.分别用携带质粒pCN-SS/SG或pNir-SS/SG的减毒沙门氏菌于第1和第16周通过胃肠途径免疫BALB/c小鼠,并于初次和再次免疫后动态监测小鼠血清和唾液中抗原特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a和IgA的产生情况,以及小鼠脾细胞的Th1/Th2因子分泌情况。第二部分:DNA疫苗pCN-SS/SG抗变链菌定植的小鼠实验1.用pCN-SS/SG转化的减毒沙门氏菌SL3261/pCN-SS/SG免疫BALB/c小鼠,同时用SL3261/pNir-SS/SG免疫组作为阳性对照,用SL3261/pCMVnir免疫组作为阴性对照。2.第二次免疫两周后,用S.mutans UA159分别口腔接种三组BALB/c小鼠,接种前后用棉签取样检测变链菌的情况。3.然后从接种后的不同时间点,即第一周至第八周检测小鼠口腔中变链菌的定植情况。结果:1.克隆抗原SBR和GBR在原核启动子nirB和真核启动子CMV的调控下,能在沙门氏菌载体SL3261和真核细胞中各自稳定地表达,在信号肽的协助下,并能可溶性地分泌至细胞外。2.质粒持续性测试表明,pCN-SS/SG能稳定地存在于生长的SL3261中,而SL3261/pCN-SS/SG能在宿主内生存4周以上。3.SL3261/pCN-SS/SG免疫BALB/c小鼠后,诱发了血清IgG和唾液分泌性IgA的产生,再次免疫后抗体反应获得显著增强,并维持在较高水平且明显强于SL3261/pNir-SS/SG诱导的抗体反应。4.IgG亚类及细胞因子分析表明,SL3261/pCN-SS/SG免疫后的小鼠血清中不仅诱导出抗原特异性IgG2a而且有IgGl;同时脾细胞经SBR和GBR刺激后产生了Th1(IFN-γ)和 Th2(IL-4、IL-10)细胞因子,且 SL3261/pCN-SS/SG 免疫组水平明显高于SL3261/pCMVnir对照组。5.在接种后的第一至八周,pCN-SS/SG和pNir-SS/SG免疫组中的变链菌水平显著低于阴性对照和空白对照组,而在第三至八周,pCN-SS/SG免疫组中的变链菌又显著低于pNir-SS/SG免疫组,且持续维持在低于空白对照组99%的水平。结论:1.双启动子CMV-nirB在载体菌SL3261和真核细胞中能很好地控制克隆抗原的表达;且表达质粒pCN-SS/SG与载体菌SL3261有很好的相容性,在宿主体内可存在较长时间。同时免疫结果表明,以减毒沙门氏菌SL3261作载体,双启动子(CMV-nirB)防龋疫苗的粘膜免疫效果,无论是在免疫强度还是持续时间上,都要优于单启动子nirB。2.以减毒沙门氏菌SL3261作载体进行粘膜免疫,双启动子DNA疫苗pCN-SS/SG表现出更强的抗变链菌定植的作用,而优于单启动子。综上所述,本实验以构建的pCN-SS/SG质粒作为抗龋DNA疫苗,以减毒沙门氏菌SL3261作载体进行粘膜免疫,成功诱导出针对变链菌PAc和GTF抗原的粘膜免疫反应。与nirB启动子单独使用相比,CMV-nirB双启动子能高效地诱导唾液IgA,从而更有效地阻止变链菌在牙面的定植。CMV-nirB这一双启动子系统作为新的策略应用于粘膜免疫,充分利用了共同粘膜免疫系统,为龋病及其它相关粘膜疾病的防止展示了有价值的前景。