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目的研究表明,表观遗传调控影响iNKT细胞的发育分化,我们前期研究发现RA患者和RA模型小鼠体内iNKT细胞数量减少,亚群比例失衡,但相关机制尚不清楚。细胞免疫治疗为重大疾病的救治提供了全新的思路和手段,是当今生物医学研究领域的热点,已广泛应用于恶性肿瘤和血液系统疾病。iNKT细胞治疗通过双向调节作用重塑机体的免疫功能,将有助于从根本上清除过度炎症引起的病理损伤和免疫紊乱,有望成为自身免疫病治疗的新战略。本课题拟从iNKT细胞发育分化异常的角度探讨RA发生的表观遗传学机制;并采用特定表型和功能的iNKT细胞过继输入RA模型小鼠体内,通过观察机体免疫状态及iNKT细胞表型和功能的改变,探讨iNKT细胞免疫过继治疗RA的表观遗传调控机制。方法1.构建类风湿关节炎(RA)模型使用hGPI325-339和hGPI465-483多肽的混合片段构建RA模型,并观察小鼠的一般临床表现;苏木素-伊红染色(HE)用于观察关节的病理变化;流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测iNKT细胞频率及亚群;微量样本多指标蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测血清细胞因子水平等,成功构建RA模型。2.诱导和获取具有特定表型和功能的iNKT细胞并进行相关鉴定及安全性评价腹腔注射α-Galcer 3天,免疫磁珠分选技术(Magnetic Cell Sorting,MACS)分选小鼠脾脏iNKT细胞,FCM检测iNKT频率及亚群;CBA检测细胞刺激上清细胞因子分泌;纯化后,用细胞膜荧光染料(DiR)标记iNKT细胞,通过小动物活体成像技术示踪iNKT细胞在RA小鼠中的迁徙、分布和代谢。3.iNKT细胞免疫过继治疗RA的疗效观察和表观遗传调控机制研究观察小鼠一般临床表现及免疫状态的改变评价治疗效果。通过FCM检测iNKT频率和亚群、CD4~+T细胞亚群,WB检测蛋白表达,qRT-PCR检测mRNA水平,ChIP-PCR检测H3K27me3和H3K4me3修饰水平,探讨iNKT细胞免疫过继治疗RA的表观遗传调控机制。结果1.RA小鼠外周血和胸腺中iNKT频率显著降低,胸腺iNKT1亚群显著增加;胸腺DP T细胞中PLZF及PLZF mRNA表达显著下降,而iNKT细胞中T-bet及T-bet mRNA表达显著增加;RA小鼠胸腺DP T细胞Zbtb16基因启动子区H3K27me3修饰水平显著增加,iNKT细胞Tbx21基因启动子区H3K4me3修饰水平显著增加;RA小鼠胸腺中UTX的表达显著降低。上述指标变化在RA小鼠炎症进展期(造模后11天)和炎症高峰期(造模14天)尤为显著。2.分离小鼠脾脏iNKT细胞,纯度达85%,其中iNKT2占92%,主要分泌IL-4。iNKT细胞过继输注至健康小鼠,死亡率为零,观察小鼠的各项评分正常。将DiR标记的iNKT细胞过继输注到RA小鼠体内主要分布在肝脏和脾脏,42天时荧光消失。iNKT细胞免疫治疗和α-Galcer治疗均可改善RA小鼠体重下降、关节红肿、足踝关节炎细胞浸润,并使血清炎性细胞因子水平降低,且iNKT细胞免疫治疗效果更明显。3.iNKT细胞免疫治疗和α-Galcer治疗均可显著提高RA小鼠外周血、脾脏、胸腺iNKT频率;纠正胸腺、脾脏iNKT亚群及脾脏CD4~+T细胞亚群的失衡;增加胸腺淋巴细胞UTX,DP T细胞中PLZF及PLZF mRNA的表达,降低iNKT细胞中T-bet及T-bet mRNA的表达;降低Zbtb16基因启动子区H3K27me3修饰水平,降低Tbx21基因启动子区H3K4me3修饰水平;且iNKT细胞免疫治疗效果更明显。另外,iNKT细胞免疫治疗可上调脾脏GATA3,Foxp3的表达,并使ROR?t,T-bet表达降低。结论1.RA小鼠iNKT细胞发育分化缺陷与关键基因Zbtb16(编码PLZF)、Tbx21(编码T-bet)启动子区H3K27和H3K4甲基化修饰水平异常相关;胸腺组蛋白去甲基化酶UTX的减少引起了H3K27me3修饰水平的增加。2.从正常小鼠脾脏获取具有特定表型和功能的iNKT细胞(iNKT2)用于免疫治疗RA小鼠,能有效缓解临床症状,且疗效优于α-Galcer治疗。3.iNKT细胞免疫治疗通过调控UTX表达以及Zbtb16和Tbx21基因启动子区组蛋白H3K27,H3K4甲基化修饰水平使iNKT细胞发育分化正常,纠正了免疫紊乱,重建了免疫平衡,从而有效缓解RA。