实验目的:利用B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统,以B型流感病毒为骨架,分别构建含有H5 2.3.4.4谱系H5N6亚型禽流感病毒HA基因的A/B嵌合流感病毒株及A/B嵌合流感病毒减毒株,作为H5亚型流感的疫苗候选株。对拯救的两种嵌合病毒进行鉴定,并初步评价其致病性以及免疫保护效力,为新型流感疫苗的研发及B型流感病毒包装机制的研究提供了新的思路。实验内容及方法:病毒的拯救与鉴定。对H5 2.3.4.4谱系HA进行改造,利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合流感病毒株和A/B型嵌合流感减毒株,对拯救成功的两种病毒株进行形态学和序列鉴定。嵌合毒株BALB/c小鼠的致病性实验。将嵌合毒株分别以10⁵EID₅₀/50μl,10⁴EID₅₀/50μl等不同剂量,嵌合减毒株分别以10⁴EID₅₀/50μl,10³EID₅₀/50μl,10²EID₅₀/50μl等不同剂量滴鼻感染小鼠,连续14天观察并记录小鼠的死亡情况和小鼠的体重变化。感染后第3天和第6天取小鼠的肺脏,研磨后滴定SPF鸡胚测定小鼠肺脏中的病毒滴度,同时确定病毒对小鼠组织的嗜性。拯救毒株的免疫实验。免疫实验分为单次免疫组和两次免疫组,均以滴鼻方式进行免疫。单次免疫实验中,嵌合病毒株的免疫剂量分别是10⁵EID₅₀/50μl,10⁴EID₅₀/50μl,嵌合减毒株的免疫剂量分别是10⁴EID₅₀/50μl,10³EID₅₀/50μl和10²EID₅₀/50μl。阳性对照组选择H5 2.3.4.4谱系的商品化H5N1灭活疫苗（RE-8）,免疫方式为肌肉注射,阴性对照组小鼠用DMEM滴鼻接种。在免疫第0天,第21天采集小鼠血清并测定血凝抑制抗体和中和抗体效价。两次免疫实验中,小鼠在第一次免疫后第21天进行第二次免疫,免疫剂量和免疫方式与单次免疫相同,在免疫第0天,第21天,第42天采集小鼠血清,测定小鼠血清中的血凝抑制抗体和中和抗体效价。拯救毒株的免疫保护实验。单次免疫组小鼠在免疫后第21天以10LD₅₀(3.63log₁₀EID₅₀/50μl)剂量的A/cat/Sichuan/SC18/2014（H5N6）野毒株进行攻毒,连续14天观察并记录小鼠的死亡情况和小鼠的体重变化情况。在攻毒后的第3天和第6天取小鼠的肺脏,研磨后滴定SPF鸡胚来测定小鼠肺脏中的病毒滴度。两次免疫组小鼠在免疫后第42天以100LD₅₀(4.63log₁₀EID₅₀/50μl)剂量的A/cat/Sichuan/SC18/2014（H5N6）的野毒株进行攻毒。观察并记录小鼠的死亡情况和体重变化,在攻毒后的第3天和第6天取小鼠的肺脏,研磨后滴定SPF鸡胚来测定小鼠肺脏中的病毒滴度。实验结果:成功拯救出了2种A/B型嵌合流感病毒株。其中A/B型嵌合流感病毒株命名为rA/B-H5-NS,A/B型嵌合流感减毒株命名为rA/B-H5-NS110。测序结果表明两株拯救病毒的序列与预期一致,并在电镜下可见流感病毒样粒子。嵌合毒株rA/B-H5-NS和嵌合减毒株rA/B-H5-NS110在MDCK细胞上的病毒滴度分别为10^6.25TCID₅₀/ml和10^4.50TCID₅₀/ml。嵌合毒株rA/B-H5-NS和嵌合减毒株rA/B-H5-NS110在鸡胚上的病毒滴度分别为10^7.64EID₅₀/ml和10^5.25EID₅₀/ml。小鼠致病性实验结果显示,以不同剂量的嵌合毒株感染小鼠,小鼠的存活率均为100%,感染的第3天在小鼠肺脏中均能检测到病毒复制,其中嵌合减毒株轻度复制。在感染第6天基本检测不到嵌合减毒株的复制。拯救病毒株的免疫实验结果显示,单次免疫组小鼠中,不同免疫剂量的嵌合减毒株均可诱导小鼠产生血凝抑制抗体（HI抗体）和中和抗体,血凝抑制效价最高达到1:640,中和抗体效价最高达到1:640。嵌合病毒株和RE-8也可诱导小鼠产生HI抗体和中和抗体。两次免疫组小鼠中,不同剂量的嵌合减毒株均可诱导产生较高水平的HI抗体和中和抗体,血凝抑制效价最高可达1:640,中和抗体效价最高可达1:5120。嵌合病毒和RE-8可诱导小鼠产生高水平HI抗体和中和抗体。单次免疫组的小鼠免疫保护实验结果显示,不同免疫剂量的嵌合减毒株组小鼠存活率均为100%,小鼠体重没有下降,仅10²EID₅₀/50μl剂量免疫组小鼠在攻毒后第3天检测到肺脏病毒复制。嵌合病毒株组小鼠存活率均为100%,体重变化不明显,未检测到肺脏病毒复制。阴性对照组小鼠死亡率为40%,但是存活的小鼠体重下降达到15%,临床发病症状明显,同时在攻毒后第3天和第6天均检测到高水平的肺脏复制滴度。RE-8组小鼠存活率为100%,小鼠体重轻微上升,且攻毒后第6天小鼠肺脏病毒滴度下降。两次免疫组的小鼠免疫保护实验结果显示,不同免疫剂量的嵌合减毒株组小鼠存活率均为100%,小鼠体重变化不明显,攻毒后第3天和第6天未检测到肺脏病毒滴度。嵌合病毒株组小鼠存活率均为100%,体重变化不大,均未检测到肺脏病毒复制。阴性对照组小鼠死亡率为100%,攻毒后第7天小鼠全部死亡,攻毒后第3天和第6天检测到高滴度的病毒复制。RE-8组小鼠存活率为100%,小鼠体重无明显下降,攻毒后第3天和第6天小鼠肺脏可检测到低水平的病毒滴度。上述实验结果表明拯救的嵌合减毒株可抵抗致死性流感病毒的攻击,有较好的免疫保护效果,同时发现嵌合病毒株亦可诱导产生HI抗体,并对小鼠产生免疫保护作用。结论:成功拯救出两株H5亚型2.3.4.4谱系流感病毒的A/B型嵌合减毒株和嵌合病毒株,两株病毒的形态学和序列测定等均正确。嵌合减毒株作为疫苗候选株对小鼠致病性较低,免疫后小鼠血清可产生较高的血凝抑制抗体和中和抗体,可完全抵抗致死性流感病毒的攻击,对小鼠产生免疫保护。嵌合病毒株也可诱导小鼠产生抗体,并对小鼠有免疫保护作用。本研究表明A/B嵌合减毒株可作为疫苗候选株,该研究为研制安全高效的新型流感疫苗奠定了基础。