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研究目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第六大恶性肿瘤,死亡率排在第三位,给人民健康造成极大威胁[1]。射频消融（Radiofrequency ablation,RFA）作为一种微创的介入治疗技术,对于直径小于3 cm的HCC具有根治性治疗作用,总体疗效也与外科切除术相当,且并发症发生率更低[3]。然而,由于消融能量在肿瘤中的分布不均,对肿瘤边缘癌细胞杀伤效率不高,最后可能导致局部复发,甚至增强癌细胞侵袭性最后导致预后不良[4]。本研究通过构建肝癌体内及体外不全热消融（incomplete RFA,iRFA）模型,进一步探究iRFA后肝癌细胞存活的分子机制;明确热休克蛋白 90（Heat shock protein 90,HSP90）以及 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）在热处理条件下抵抗细胞凋亡的内在机制;同时评估新型口服HSP90抑制剂XL888增强iRFA条件下肝癌细胞的热敏感性,为射频联合小分子抑制剂治疗肝癌提供新方向。研究方法:1、采用CCK8检测热处理及药物处理后细胞活性情况;2、集落形成实验检测热处理及药物对细胞增殖的影响;3、应用Hoechst 33258检测药物与热处理后细胞核变化情况;4、蛋白免疫印迹技术（Western blotting）检测目标蛋白的表达;5、构建裸鼠体内iRFA模型用于后续实验验证;6、采用RT-qPCR方法检测目的基因的mRNA水平表达;7、免疫共聚焦检测目标蛋白细胞内表达及定位;8、采用cDNA质粒转染过表达目标蛋白;9、采用免疫共沉淀法分析蛋白质复合物的形成;10、免疫组化检测异体肿瘤组织内蛋白表达情况;结果:1.首先评估HSP90与STAT3在肝癌临床组织中的相关性。TCGA数据库临床肝癌mRNA数据分析显示,HSP90与STAT3二者相关系数为0.32,存在相关性;2.肝癌组织免疫组化结果提示HSP90及STAT3肿瘤内协同表达增高。其中在高表达HSP90的标本内STAT3表达也上调,且二者与肿瘤分期、高AFP密切相关;3.构建体外亚致死热处理模型。应用CCK8检测不同温度及时间梯度处理后细胞活性情况,在48℃及以上温度条件下,细胞活性明显受到抑制,而在46℃及以下温度时,细胞活性几乎未受影响,同理选取10min持续处理时间作为后续亚致死处理条件;4.亚致死热处理条件下HSP90与STAT3互作增强。IP结果证实生理条件下HSP90与STAT3存在相互结合,而热处理增加了二者之间的结合作用,并且Western blotting结果提示STAT3蛋白表达增高,同时其下游重要抗凋亡蛋白Mcl-1（myeloidcell lekemia-1）及Bcl-xL表达也有所升高,并且在mRNA水平也证实二者表达增高;5.热处理条件下STAT3活化情况增多并促进p-STAT3入核。提取核蛋白行Western blotting结果显示热处理诱导p-STAT3入核增加,并发挥转录因子活性;6.热处理条件下HSP90与STAT3的结合在体内发挥抗凋亡活性。我们应用裸鼠皮下成瘤方式,成功在小鼠体内移植肝癌细胞系,待肿瘤最大径长至0.8cm时,应用有效射频直径1cm的射频针穿刺至小鼠体内,按照5W、60s的条件进行不全射频消融,随后剖开肿瘤可见肿瘤内部凝固型坏死周围过渡带,并且小鼠存活良好无感染等并发症,显示成功构建体内不全射频模型;7.不全RFA刺激肿瘤向恶性表型转化。每周测量肿瘤最大径及垂直横径,结果显示在iRFA早期,肿瘤体积较对照组明显缩小,但随着喂养时间延长,肿瘤生长速度明显加快,虽然至喂养结束时体积仍小于对照组,但是增长速率已经明显增快,免疫组化结果显示Ki-67在iRFA表达增多;8.XL888对肝癌细胞杀伤呈现浓度依赖及时间依赖性。首先在体外应用不同浓度XL888及不同时间处理肝癌细胞后,CCK8检测细胞活性变化情况,结果提示随着XL888浓度升高及时间延长,对细胞活性抑制逐渐明显;9.热处理联合XL888促进肝癌细胞凋亡。在选取100nm作为处理浓度后,CCK8结果提示联合处理细胞活性较单独加药及热处理组明显减低,并且随着XL888浓度升高,联合处理组杀伤肿瘤作用更加明显,Hoechst 33258染色结果提示联合处理可诱导细胞核固缩,提示XL888可增强肝癌细胞热敏感性;10.XL888联合热处理通过活化Bcl-2通路及诱导caspase3活化促进肝癌细胞凋亡。Western blotting结果提示联合处理条件下BCL-2家族重要成员Mcl-1及Bcl-xL变化显著,同时caspase3及PARP明显活化;11.XL888通过破坏HSP90-STAT3相互结合从而促进肝癌细胞的热敏感性。IP结果提示XL888处理后HSP90与STAT3结合明显减少,同时蛋白水平检测发现STAT3及p-STAT3活性明显减低;12.联合处理抑制p-STAT3入核。提取核蛋白并检测p-STAT3表达发现其核内表达明显减少,且下游靶蛋白Mcl-1及Bcl-xL表达减低;13.XL888联合热处理通过STAT3发挥促凋亡作用。在联合处理的肝癌细胞内转染STAT3 cDNA后,CCK8检测发现细胞活性较联合处理组有所恢复,同时凋亡相关蛋白表达相应减少;14.XL888在体内增强iRFA杀伤肿瘤作用。体外构建不全RFA模型同时联合XL888灌胃处理后,定期测量小鼠肿瘤直径并于21天后处死小鼠,结果发现小鼠肿瘤体积及重量较对照组及单独处理组明显减少;15.XL888对小鼠正常肝肾组织无明显损伤。在安全性方面,分离得到小鼠肝肾组织行免疫组化,HE染色结果可见所有加药处理组小鼠未见明显组织损伤及坏死。结论:肝癌组织内HSP90与STAT3表达存在相关性,并且在肝癌细胞系内二者存在直接结合作用;此外,热处理可增强HSP90与STAT3的直接结合作用,并且这种结合作用可诱导STAT3活化并入核,增加STAT3下游抗凋亡蛋白Mcl-1及Bcl-xL的表达,从而在热激条件下抑制肝癌细胞凋亡;而联合应用新型HSP90抑制剂XL888可破坏HSP90-STAT3复合物形成,增强Bcl-2家族凋亡蛋白表达,活化caspase3及PARP蛋白,从而增加肝癌细胞的热敏感性。