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[目的]骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一类发病率高、危害大,易发生脆性骨折为特征的全身代谢性骨病。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)成骨分化能力减弱,成脂分化能力增强是导致OP的原因之一,改变BMMSCs分化方向成为治疗OP的潜在方法。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类广泛存在于真核细胞生物的短序列非编码RNA,通过降解靶基因mRNA或抑制翻译来调节细胞的增殖、分化和凋亡等过程。最近的研究表明miRNA在BMMSCs成骨分化中具有重要的调节作用,关于其在成骨发生发展过程中所起的作用,已经日益成为研究热点。前期课题组发现miR-223-3p在骨质疏松小鼠BMMSCs中表达上调,但其是否导致了 OP的发生发展至今未见报导。本课题旨在研究miR-223-3p在人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMMSCs)成骨分化中的作用,预测并验证其靶基因,阐明miR-223-3p调控hBMMSCs成骨分化的分子机制,以期为OP的诊断和治疗提供新的理论依据。[方法]1.原代hBMMSCs分离与培养:在全髋关节置换手术过程中收取骨髓,利用全骨髓贴壁法分离培养hBMMSCs,镜下观察其形态特点。2.验证高通量测序结果:将收集的细胞分为骨质疏松组和骨量正常组,利用qRT-PCR技术检测miR-223-3p在俩组细胞的表达水平。3.验证miR-223-3p在hBMMSCs成骨分化中的作用:在成骨诱导分化不同时间点提取细胞总RNA,qRT-PCR技术检测miR-223-3p表达趋势。采用细胞转染技术改变细胞中miR-223-3p的内源性表达水平,将其分为:①空白对照组;②NC组;③miR-223-3p mimic 组;④miR-223-3p inhibitor 组。成骨诱导分化 7天后,检测成骨标志性基因Runx2和OPN的表达,成骨诱导21天后,茜素红染色观察钙化结节表达。4.miR-223-3p靶基因的验证:生物信息学分析和靶基因预测软件分析可能与miR-223-3p结合的下游靶基因,结合文献筛选与成骨密切相关的靶基因,抑制或过表达miR-223-3p后,Western Blot分析靶基因蛋白表达水平。[结果]1.通过全骨髓贴壁法分离、培养的原代hBMMSCs生长缓慢,细胞呈长梭形或多角形,随着换液次数的增多,细胞逐渐纯化,经过传代的细胞生长迅速,细胞活性好。2.在骨质疏松患者BMMSCs中,miR-223-3p表达显著上调。3.在成骨诱导分化过程中,随着诱导时间的延长,miR-223-3p的表达逐渐下降。miR-223-3p mimic组成骨相关基因Runx2和OPN表达下调,茜素红染色阳性结节减少。而miR-223-3p inhibitor组成骨相关基因Runx2和OPN表达上调,茜素红染色阳性结节增多。4.靶基因预测软件发现与成骨分化密切相关的FOXO1是miR-223-3p下游靶基因之一,进一步通过Western Blot技术证明了FOXO1是miR-223-3p的靶基因。[结论]1.在髋关节置换过程中收取骨髓,分离培养的hBMMSCs活性好,纯度高,可以作为获取hBMMSCs的一种方法。2.miR-223-3p在骨质疏松hBMMSCs中表达上调,且在成骨诱导分化过程中表达下调。3.miR-223-3p通过靶向调控FOXO1的表达而抑制hBMMSCs成骨分化,进而导致骨质疏松的发生发展。4.miR-223-3p可能成为临床上诊断骨质疏松和判断预后新的标志物,以及治疗骨质疏松的潜在靶点。