(一)研究背景糖尿病是一种严重影响人类健康的全球性常见病、多发病。已有统计数据显示:目前全球罹患糖尿病者约4.22亿,几乎占了全人类的8.50%,预计到2040年将增加到6.4亿,而在我国这一比例更是达到了15.50%。糖尿病足溃疡是与糖尿病相关的最常见、最严重的并发症,其发病率高达25%,糖尿病足溃疡患者中有15%以上可能面临截肢甚至死亡的风险。糖尿病足溃疡治疗既往以内科控制血糖、抗感染,配合外科局部清创为主,然而治疗效果并不理想,以致患者最终仍面临着截肢或截趾的风险。因此,探求新的治疗靶点及策略已成为糖尿病溃疡创面修复研究的热点与难点。近年来,有报道采用Ilizarov微循环重建技术治疗糖尿病足溃疡取得了较好的临床疗效,成功的保留了许多濒临截肢的患者的肢体。Ilizarov微循环重建技术是基于Ilizarov张力应力法则开发出来的治疗下肢缺血性疾病的措施。既往研究表明,Ilizarov微循环重建技术不仅能够促进骨骼间的微血管再生,而且可有效促进皮肤、软组织的血管再生,从而加速糖尿病足溃疡的愈合。目前对Ilizarov微循环重建技术的研究多从血管造影、彩色多普勒超声、X线等方面进行,而对于血管再生及血管重塑的机制研究鲜见。因此,本研究拟通过应用Ilizarov微循环重建技术治疗糖尿病足溃疡创面兔模型,观察其有效性,并采用Western Blot、Real-time PCR等技术,从DLL4/Notch信号通路探讨该技术促进糖尿病足溃疡愈合的有效性及其分子机制,为临床应用该技术防治糖尿病足溃疡提供有效的治疗方法和坚实的理论依据。(二)目的观察Ilizarov微循环重建术对糖尿病足溃疡患者外周血中的VEGF、b FGF表达的影响,以及对新西兰兔糖尿病足溃疡创缘肉芽组织的VEGF、Notch1和DLL4 m RNA的转录水平和VEGF、Notch1、b FGF蛋白的表达的影响,探讨Ilizarov微循环重建技术对糖尿病足溃疡愈合作用的机制。(三)方法第一部分(临床研究):选取20例糖尿病足溃疡患者,随机分为Ilizarov组和贝复新组,其中Ilizarov组9例,贝复新组11例,分别观察治疗前、治疗后2 w、4 w和8 w创面愈合情况;在术前及术后8 w应用CTA检查肢体血管再生情况;用ELISA法检测治疗前后外周血VEGF和b FGF的表达情况。第二部分(实验研究):(1)实验一:自行研究设计兔胫骨横向骨搬移外固定支架,安放于4只新西兰兔左胫骨上段内侧。术后第4天开始搬移骨块,每天向外搬移0.5 mm,分2次完成,旋转2圈为0.125 mm,0.25 mm/次,1次/12h,2次/d,共7 d,搬移距离3.5 mm。向外搬移结束后第2天以同样的方法往回搬移骨块,共7 d完成往回胫骨横搬(手风琴技术),将胫骨块搬移回原位后维持2w后拆除胫骨搬移架。(2)实验二:将72只新西兰兔随机分为空白对照组、模型组、贝复新组(重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶组)和Ilizarov组,每组18只。模型组、贝复新组和Ilizarov组建立糖尿病足溃疡模型,空白对照组仅在足部建立急性创面。Ilizarov组按照实验(1)的方法进行胫骨横向搬移,贝复新组给予贝复新外用治疗,模型组及空白对照组给予生理盐水换药治疗。分别进行创面愈合率分析、HE染色观察皮肤组织病理学改变及进行血管化程度定量分析。各组分别于干预后第3天、第10天、第17天这3个时相点取创面相同部位的肉芽组织,用Western Blot法测定创缘组织中VEGF、Notch1和b FGF蛋白的表达情况,用Real-time PCR测定创缘组织中VEGF、Notch1和DLL4 m RNA的转录水平。(四)结果第一部分:Ilizarov组,所有9例患者行胫骨横向搬移术后2 w创面开始有新鲜肉芽组织生长,4 w后可以看到创面明显缩小,第4周及第8周时,实验组愈合速度较对照组明显加快,差异有统计学意义(P<0.05)。最终所有足部溃疡均得到愈合,愈合时间平均9.0±1.9 w,较对照组(12.7±3.7 w)明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组愈合后疤痕组织较少。术后8 w血管造影显示小腿及足部侧支动脉及局部微小动脉明显增加,术后12 w测量踝肱指数显示,实验组治疗后踝肱指数较治疗前好转(P<0.00)。Ilizarov组治疗后第1周、第2周和第4周外周血血清VEGF、b FGF较术前明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),对照组治疗后第2周外周血VEGF、b FGF较术前有所升高,余各个时间点无明显变化(P>0.05)。第二部分:1、胫骨横向骨搬移外固定支架成功安放于新西兰兔胫骨上段内侧,通过调节牵张器可对胫骨上段骨折块进行有效横向搬移,稳定性良好,性能优良。2、Ilizarov组创面的修复组织疤痕组织较少,毛发生长良好,接近原位再生。各组之间愈合率比较:第7天,各组之间的愈合率比较,差异无统计学意义(P>0.05);第14天,Ilizarov组、空白对照组明显快于贝复新组及模型组,差异有统计学意义(P<0.01),Ilizarov组和空白对照组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);第21天,模型组与其他三组比较,差异有统计学意义(P<0.01),余各组之间的愈合率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组之间阳性血管数量比较:第7天,Ilizarov组、空白对照组及贝复新组阳性血管数量均多于模型组,差异有统计学意义(P<0.00);第14天,空白对照组阳性血管数量多于其他三组,差异有统计学意义(P<0.00),余各组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3、Real Time PCR结果显示,Ilizarov组和贝复新组兔创面肉芽组织中VEGF、Notch1和DLL4 m RNA的表达水平在3个时相点呈现增高-降低趋势,空白对照组呈逐渐下降趋势,模型组无明显变化。干预第10天,Ilizarov组升高更明显,与贝复新组相比,差异有统计学意义(P<0.05);与第3天相比,差异有统计学意义(P<0.05)。West blot结果显示,Ilizarov组和贝复新组兔创缘组织中VEGF、Notch1和b FGF蛋白的表达水平在3个时相点呈现增高-降低的趋势,空白对照组呈现由高到低的趋势,而模型组无明显变化。Ilizarov组的VEGF蛋白表达水平在第10天时高于贝复新组,差异有统计学意义(P<0.05)。Ilizarov组的Notch1、b FGF蛋白表达水平在第10天和17天时均高于贝复新组,差异有统计学意义(P<0.05)。(五)结论1.Ilizarov微循环重建技术能够刺激糖尿病足溃疡患者肢体远端缺血组织的血管再生,促进糖尿病足溃疡的修复。2.此胫骨横向骨搬移牵张器具有制作简单、轻便易操作,价格低廉的特点,可有效实施胫骨上段横向骨搬移实验,适合科研人员在胫骨上段骨横向搬移的实验研究中应用。3.Ilizarov微循环重建技术可能通过增强VEGF、Notch1和b FGF蛋白表达水平和VEGF、Notch1和DLL4 m RNA转录水平,使相应蛋白表达增强,发挥其增进血管新生、重建微循环的作用,从而促进糖尿病足溃疡愈合、提高创面愈合率、缩短愈合时间、减轻瘢痕增生。