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背景:体细胞中基因表达和蛋白翻译后修饰是调控细胞功能的主要方式。然而,成熟精子具有高度浓缩的染色质结构,核基因被认为表达沉默。因此,成熟精子更可能依赖于蛋白质翻译后修饰来实现功能调控。在成熟精子中研究最为广泛的蛋白翻译后修饰是蛋白磷酸化,它在精子运动、超活化、获能和顶体反应等功能中发挥着至关重要的作用。尽管赖氨酸翻译后修饰是蛋白质翻译后修饰热点,但是其在成熟精子中鲜有研究。赖氨酸被修饰后会改变蛋白质电荷和物理性质,从而改变蛋白质结构影响其功能。目前,超过近百种的赖氨酸翻译后修饰被相继发现,其中赖氨酸琥珀酰化(Lysine succinylation,Ksuc)是近年发现的一种新型的蛋白质翻译后修饰,是赖氨酸残基上结合了一个带两个负电荷的四碳琥珀酰基基团,使得赖氨酸基团电荷从+1变为-1。这种电荷性质的改变与蛋白磷酸化的效应类似,能改变蛋白结构调控其功能。Ksuc是一种保守的蛋白翻译后修饰,其在真核生物和原核生物中普遍存在,这种保守的修饰方式很可能在成熟精子中保留下来。此外,成熟精子运动等功能与能量代谢密切相关,而作为调节细胞能量代谢的重要方式之一,Ksuc很可能参与精子功能调控。因此,本文在人成熟精子中系统研究了Ksuc的定位、Ksuc调控系统以及Ksuc的功能和可能调控机制。实验目的:本文旨在人成熟精子中系统研究了Ksuc的定位、Ksuc调控系统以及Ksuc的功能和可能调控机制,为开发精子功能调控化合物提供新的分子靶点。实验方法:1、采用免疫印迹法和基于激光共聚焦显微镜和结构照明超分辨显微镜的免疫荧光法检测人成熟精子中Ksuc的存在及分布情况。2、采用免疫印迹法检测酶抑制剂和琥珀酸钠(Na-suc)处理的正常人成熟精子中Ksuc含量变化,确定人精子中Ksuc调控系统(调控酶和辅因子)。3、通过琥珀酰化调控酶抑制剂和琥珀酸钠改变正常人精子中琥珀酰化含量,再利用计算机辅助精液分析系统以及精子穿甲基纤维素实验,评价Ksuc对人精子运动的影响。4、利用Ksuc蛋白质组学鉴定正常人精子中琥珀酰化修饰蛋白质和具体修饰位点。5、利用免疫印迹法大样本筛查正常人和弱精子症精子中Ksuc含量,再用统计分析学方法分析Ksuc在正常精子和弱精子中的含量差异。6、免疫印迹法和计算机辅助精子分析评估Na-suc是否能够提高Ksuc含量下降的弱精子症精子中Ksuc含量和前向运动率,进一步明确Ksuc在弱精子症中的作用。7、酶标法检测Na-suc是否能够提高Ksuc含量下降的弱精子症精子中ATP含量和糖酵解速率;利用免疫印迹法大样本筛查正常人和弱精子症精子中α-酮戊二酸脱氢酶(KGDHC)三个组成蛋白的含量,再用统计分析学方法分析KGDHC在正常精子和弱精子中的含量差异;揭示Ksuc含量下降的弱精子症的可能发病机制。结果:1、人成熟精子中能检测到赖氨酸琥珀酰化,存在于20-150 kDa的蛋白中,且与Hela细胞中的分布不同;琥珀酰化修蛋白主要定位在精子尾部,尤其在精子中段和主段中集中分布。2、免疫印迹实验结果表明:去酰基化酶Sirtuins抑制剂烟酰胺(NAM)和KGDHC抑制剂琥珀酰磷酸酯(SP)分别提高和降低人成熟精子中赖氨酸琥珀酰化水平,暗示Sirtuins和KGDHC参与调控人成熟精子中Ksuc;Na-suc能特异性增加人成熟精子赖氨酸琥珀酰化,证明琥珀酰辅酶A同样是人成熟精子中琥珀酰化的酰基供体。3、精子功能实验结果表明:利用SP降低人成熟精子Ksuc水平后能抑制人精子的总运动率、前向运动率和穿粘液等运动能力。4、琥珀酰化蛋白质组学共鉴定出788个赖氨酸琥珀酰化修饰位点分布在251个蛋白上;蛋白质基序分析表明人精子中Ksuc比较容易发生的motif类型是..........K.V........基序;GO和KEGG富集分析显示人精子中琥珀酰化修饰蛋白主要参与能量代谢等通路。5、大样本筛查结果表明:弱精子症精子中的Ksuc和KGDHC主要亚基二氢硫辛酰基琥珀酰转移酶(E2k)含量均显著低于正常人精子中含量(P<0.001);通过Na-suc特异性提高Ksuc含量下降的弱精子症精子中Ksuc含量后能恢复这些病人精子前向运动率、ATP含量以及糖酵解速率。结论:综上所述,人精子中同样存在Ksuc,其含量受调控酶(Sirtuins和KGDHC)和辅因子(琥珀酰辅酶A)的调节。Ksuc参与调控人精子运动,其含量下降可能是弱精子症的病因之一,且Ksuc含量下降的弱精子症发病机制与二氢硫辛酰基琥珀酰转移酶、精子中ATP含量以及糖酵解速率下降有关。