增殖细胞核抗原(PCNA)是仅存在于增殖细胞的细胞核中的一类蛋白质,通常被用作细胞增殖的标记物。通过对虹鳟外周血及造血器官中PCNA表达的定位研究,可以确定外周血红细胞及造血器官中细胞的增殖能力,从而为鱼类多倍体红细胞研究提供基础资料。本试验观察并对比了二、三倍体虹鳟Oncorhychus mykiss(Walbaum)外周血红细胞的形态结构的差异;运用免疫细胞化学方法、免疫组织化学方法检测外周血红细胞中是否存在增殖细胞核抗原(PCNA)的表达并对其进行了定位研究。运用流式细胞术对外周血红细胞PCNA的表达量进行了定量研究;检测了二三倍体虹鳟外周血中S期红细胞所占比例;对造血器官中PCNA的表达进行了定位研究,确定了造血组织的分布及各器官造血的活跃程度。试验结果表明:1.三倍体虹鳟外周血红细胞与二倍体相比较体积较大,细胞形态更为细长。三倍体红细胞及其细胞核的体积分别为二倍体的1.49倍和1.50倍,与理论值1.50倍相符合。在三倍体虹鳟外周血中可见一定比例的畸形红细胞,可以大概分为缢痕型、哑铃型和不规则型。这些畸形细胞在二倍体中也有少量存在,但比例极小。二、三倍体中畸形细胞的比例分别为0.08%和8.5%。在二、三倍体的外周血液中还可见一定比例的未成熟红细胞,分别占红细胞总数的8%和11.9%,二、三倍体之间差异极显著。2.通过光学显微镜观察免疫组织化学染色后二、三倍体的红细胞中有棕黄色沉淀附着的PCNA阳性染色细胞占整个红系细胞总数的0.2%和6.4%(试验所用抗体为小鼠抗PCNA单克隆抗体(克隆号:PC10))。阳性染色细胞的形态与未成熟红细胞的形态一致或相近。三倍体中呈PCNA阳性的细胞约占未成熟红细胞总数的57.9%。而二倍体中PCNA阳性细胞数量极少,仅占未成熟红细胞数的2.5%。3.流式细胞仪检测二、三倍体外周血液中红细胞处于S期的细胞比例分别为0.68%和4.05%,差异极显著。通过荧光抗体标记并进行流式细胞仪检测得到二、三倍体中有PCNA阳性表达的红细胞比例分别为0.37%和8.39%,差异极显著。4.抗PCNA单克隆抗体(PC10)可以与细胞中增殖细胞核抗原特异性结合,通过蛋白质电泳检测出一条由免疫反应产生的35-36 kDa的蛋白质条带。并且可以看出,抗PCNA单克隆抗体(PC10)可以与大鼠脾脏,以及虹鳟肝脏、肾脏和三倍体外周血细胞发生交叉反应,其可用于对虹鳟增殖细胞核抗原的检测。5.采用TUNEL法检测虹鳟外周血中的凋亡细胞,无论二倍体还是三倍体的外周血中均有呈棕黄色染色的凋亡细胞,但这些细胞属于血液中自然凋亡细胞。畸形红细胞在TUNEL检测中并未表现出凋亡细胞所应有的棕黄色沉淀,所以它们不是凋亡细胞。从而排除了畸形细胞产生的一种可能性即细胞凋亡。6.检测虹鳟造血器官中PCNA的表达可知,头肾中大量造血祖细胞集中分布于血窦内并且呈较强的PCNA阳性。造血祖细胞在头肾组织中也有广泛分布,并且增殖活跃。在肾脏中,PCNA阳性细胞均匀分布于肾小管和集合管之间,均为造血细胞。同时小管内皮细胞也有阳性染色。脾脏网状结构内有大量血细胞分布,其中有部分细胞呈现PCNA阳性染色为造血祖细胞。肝脏中有少量肝细胞也表现PCNA阳性染色,而肝细胞中可见双核或哑铃形细胞;肝脏中的造血组织主要分布于肝血窦及被膜下区域,PCNA免疫组织化学反应后可观察到阳性染色。