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本研究旨在初步探讨环状RNA circVAPA通过竞争性结合miR-130a-5p促进人乳腺癌细胞侵袭和迁移的作用,以及紫草素在此过程中的干预作用,并分析其可能的作用机制。以此为转移性乳腺癌的中西医结合诊断和治疗提供新的分子靶标,也为指导临床使用紫草素治疗乳腺癌提供理论依据。研究内容分为三部分:第一部分CircVAPA在乳腺癌中的表达及临床意义目的:研究环状RNA circVAPA在乳腺癌组织和细胞中的表达情况,探讨其在调控乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用。方法:(1)利用环状RNA高通量测序分析3例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本中环状RNA的表达情况。(2)利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)在29例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本以及人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中检测circVAPA的表达情况,并通过Sanger测序判断circVAPA的接头序列。(3)构建circVAPA过表达质粒(p-circVAPA),通过转染过表达质粒使低侵袭性的乳腺癌细胞株MCF-7过表达circVAPA后进行功能学实验,探索过表达circVAPA对MCF-7细胞的生物学特性的影响。同时,在高侵袭性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231中转染siRNA(specific interfering RNA)敲低circVAPA的表达后进行功能学实验,探索circVAPA低表达对MDA-MB-231细胞的生物学特性的影响。结果:(1)与癌旁组织相比,circVAPA在乳腺癌组织中高表达;与淋巴结阴性组织相比,circVAPA在淋巴结阳性组织中高表达。(2)与低侵袭性的MCF-7细胞相比,circVAPA在高侵袭性的MDA-MB-231细胞中高表达。(3)过表达circVAPA的MCF-7细胞株的侵袭及迁移能力显著增强,而敲除circVAPA的MDA-MB-231细胞株的侵袭及迁移能力明显减弱。结论:环状RNA circVAPA表达水平与乳腺癌细胞侵袭转移能力呈正相关,异常表达的circVAPA能够影响乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。第二部分紫草素在体内外对乳腺癌发生发展的抑制作用目的:在体外细胞株中研究紫草素(shikonin)对乳腺癌增殖、侵袭和迁移的影响,并在体内动物模型中探讨紫草素对乳腺癌的抑瘤作用。方法:(1)选择不同浓度的紫草素(1,2,4,8,16,32,64 μM)分别处理人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,利用MTT法测定紫草素对乳腺癌细胞增殖的抑制率和半数致死量(IC50)。采用流式细胞术观察紫草素处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h后的细胞凋亡率。确定紫草素在两株细胞中的无毒剂量。(2)利用EdU细胞增殖检测技术观察不同浓度紫草素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用;利用细胞划痕及Transwell实验检测紫草素处理24 h后细胞侵袭和迁移的变化。(3)建立人乳腺癌细胞MDA-MB-231异种移植瘤裸鼠模型,使用不同剂量紫草素对裸鼠进行药物治疗,检测紫草素对裸鼠瘤体的生长抑制作用,并观察其毒副作用。结果:(1)紫草素对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖具有抑制作用,其作用效应呈一定的浓度和时间依赖性。(2)2,4 μM浓度的紫草素能够显著抑制MCF-7细胞的侵袭及迁移能力;8μM浓度的紫草素能够显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力。(3)高剂量紫草素(15 mg/kg/d)对人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠的瘤体具有明显的生长抑制作用且无明显毒副作用。结论:中药单体紫草素不仅能够在体外有效抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,在体内依然可以显著抑制乳腺癌移植瘤的生长,在乳腺癌的治疗中具有潜在应用价值。第三部分CircVAPA/miR-130a-5p调节轴促进乳腺癌侵袭迁移及紫草素的干预作用目的:研究环状RNA circVAPA对乳腺癌侵袭迁移发挥作用的具体机制,并探讨紫草素在circVAPA/miR-130a-5p调节轴中的干预作用。方法:(1)利用原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)判断 circVAPA 在细胞中的定位。(2)利用miRNA高通量测序分析3例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本中miRNA的表达;采用生物信息学软件预测circVAPA可能的下游miRNA,与miRNA高通量测序结果取交集。(3)利用RT-qPCR在29例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本以及人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中检测miR-130a-5p的表达情况。(4)使用双荧光素酶报告基因检测circVAPA与miR-130a-5p是否存在吸附关系。对MDA-MB-231细胞进行miR-130a-5p模拟物(mimics)的转染,划痕实验及Transwell实验证实miR-130a-5p的功能。最后通过功能恢复实验,验证过表达circVAPA是否能抑制miR-130a-5p的生物学功能。(5)利用RT-qPCR在紫草素处理MDA-MB-231细胞前后检测miR-130a-5p的表达情况。对紫草素处理后的MDA-MB-231细胞进行miR-130a-5p抑制物(inhibitor)的转染,从反面证实紫草素在乳腺癌细胞中通过上调miR-130a-5p发挥功能。(6)利用RT-qPCR检测亲本基因VAPA在MCF-7和MDA-MB-231中的表达以及过表达和敲除circVAPA后VAPA的表达水平。用Kaplan-Meier生存分析方法分析1764位乳腺癌患者的生存数据。结果:(1)原位杂交技术证实circVAPA主要存在于乳腺癌细胞的细胞质中。(2)与癌旁组织相比,miR-130a-5p在乳腺癌组织中低表达;与淋巴结阴性组织相比,miR-130a-5p在淋巴结阳性组织中低表达。(3)与低侵袭性的MCF-7细胞相比,miR-130a-5p在高侵袭性的MDA-MB-231细胞中低表达。(4)生物信息学预测表明miR-130a-5p包含一个与circVAPA匹配的结合位点并且有很强的结合可能性。双荧光素酶报告系统结果提示circVAPA能够通过结合位点吸附miR-130a-5p。同时,划痕实验及transwell迁移实验均表明miR-130a-5p能降低MDA-MB-231细胞株的侵袭迁移能力。由circVAPA和miR-130a-5p的相反的生物学功能,提示circVAPA可以竞争性结合miR-130a-5p抑制其在MDA-MB-231细胞中的抗侵袭和迁移能力。(5)RT-qPCR结果发现经紫草素处理后,miR-130a-5p在MDA-MB-231细胞中的表达上调。同时,划痕实验及Transwell实验均证实紫草素在乳腺癌细胞中通过上调miR-130a-5p恢复其抗侵袭和迁移能力。(6)Kaplan-Meier生存分析结果表明VAPA基因的低表达与较差的无病生存率(DFS)密切相关。上调或者下调circVAPA的表达不会影响VAPA在乳腺癌细胞中的表达。结论:CircVAPA通过竞争性结合miR-130a-5p促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移;紫草素在一定程度上能通过干预circVAPA/miR-130a-5p调节轴抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。