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目的:研究AMPK抑制剂Compound C诱导人胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)细胞发生自噬的分子机制;方法:实验通过培养人胆管癌细胞株QBC939和RBE细胞,采用Compound C进行处理,采用自噬抑制剂3-MA、Bafilomycin A1(BAF)单独或与Compound C联合处理细胞、Akt/mTOR抑制剂LY294002(LY)/Rapamycin(Rap)单独或与Compound C联合处理细胞,JNK抑制剂SP600125(SP)、p53抑制剂Pifithrin-α(PFT-α)或转染siRNA干扰JNK、p53的表达、p38MAPK抑制剂SB203580(SB)单独或与Compound C联合处理细胞,通过细胞免疫荧光染色检测细胞自噬,用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性,免疫印迹(Western blot)分析自噬和凋亡相关分子LC3A/B、PARP、p53等蛋白表达水平及实时荧光定量PCR检测p53、MDM2的mRNA表达水平。结果:(1)Compound C诱导人CCA细胞发生死亡:乳酸脱氢酶(LDH)释放结果表明Compound C有效诱导QBC939和RBE细胞死亡。Western blot结果表明Compound C诱导QBC939和RBE细胞中凋亡分子标记物PARP的活化剪切,与细胞死亡结果有较好的一致性。这些结果提示Compound C诱导人CCA细胞发生死亡,且呈剂量-时间依赖性;(2)Compound C诱导人CCA细胞发生自噬:细胞免疫荧光结果表明Compound C处理后人CCA细胞出现LC3A/B荧光颗粒,且呈剂量-时间依赖性;此外,Western blot结果说明Compound C诱导LC3A/B表达。结果提示Compound C诱导人CCA细胞发生自噬。(3)抑制自噬促进Compound C诱导人CCA细胞死亡:LDH释放结果表明自噬抑制剂3-MA和BAF阻断自噬发生后显著增加Compound C诱导的QBC939和RBE细胞死亡。此外,Western blot结果也表明用3-MA和BAF阻断自噬发生后显著增加Compound C诱导的QBC939和RBE细胞凋亡,与LDH结果一致。结果提示自噬的诱导减弱Compound C诱导的人CCA细胞死亡(4)Compound C诱导人CCA细胞发生的自噬不依赖于Akt/mTOR通路:Western blot结果表明Compound C处理QBC939和RBE细胞后p-Akt上调,p-p70s6k未见明显变化。此外,LY/Rap分别阻断Akt/mTOR通路后,Compound C诱导的QBC939和RBE细胞自噬未受影响。结果提示Akt/mTOR通路不参与Compound C诱导的人CCA细胞自噬的调节。(5)阻断JNK抑制Compound C对人CCA细胞自噬的诱导:Western blot结果表明SP阻断细胞JNK的活性后,明显减弱Compound C诱导的QBC939和RBE细胞自噬。转染siRNA干扰JNK的表达也明显减弱Compound C诱导的QBC939和RBE细胞自噬。结果提示JNK参与Compound C诱导的人CCA细胞自噬的调节。(6)抑制p38MAPK促进Compound C对人CCA细胞自噬的诱导:Western blot结果表明尽管Compound C激活QBC939和RBE细胞p38MAPK活性,但是SB阻断细胞p38MAPK的活性后,促进了Compound C对细胞自噬的诱导。结果提示p38MAPK参与Compound C诱导人CCA细胞发生自噬的调节。(7)抑制p38MAPK通过增强JNK促进Compound C对人CCA细胞自噬的诱导:Western blot结果表明SB阻断细胞p38MAPK的活性后,促进了QBC939和RBE细胞中JNK活性上调;此外,SP阻断细胞JNK的活性后,减弱了抑制p38MAPK促进Compound C诱导QBC939和RBE细胞自噬。这些结果提示JNK活化参与了抑制p38MAPK促进Compound C诱导人CCA细胞发生自噬的调节。(8)阻断p53抑制Compound C对人CCA细胞自噬的诱导:实时荧光定量PCR和Western blot检测结果表明Compound C诱导QBC939和RBE细胞p53表达。此外,Western blot结果说明PFT-α阻断细胞p53的活性后,明显减弱Compound C诱导的QBC939和RBE细胞自噬。转染siRNA干扰p53的表达也明显减弱Compound C诱导的QBC939和RBE细胞自噬。结果提示p53参与Compound C诱导人CCA细胞发生自噬的调节。(9)Compound C诱导人CCA细胞凋亡不依赖于Akt/mTOR通路:Western blot结果表明LY/Rap分别阻断细胞Akt/mTOR通路后,Compound C诱导QBC939和RBE细胞凋亡未受影响。结果提示Akt/mTOR通路不涉及Compound C诱导的人CCA细胞的细胞凋亡调节。结论:Compound C诱导人CCA细胞发生死亡;Compound C诱导人CCA细胞发生自噬,并且自噬的诱导保护了Compound C对人CCA细胞引起的杀伤作用;Compound C诱导人CCA细胞发生的自噬反应受JNK和p53通路调控,而不依赖于Akt/mTOR通路调控。