背景与目的电子心脏起搏器是目前临床上治疗缓慢性心律失常（病态窦房结综合征及完全性房室传导阻滞等）的有效方法。虽然电子心脏起搏器治疗已挽救了数百万患者的生命，但因电子心脏起搏器植入术存在诸多问题（如缺乏对机体神经递质变化的自动反应性、电极位置不稳定、电池寿命有限、严重感染及电磁干扰等）而并非最佳选择。鉴于上述原因，基于细胞和基因治疗的“生物起搏器”已成为当前缓慢性心律失常治疗领域研究的热点之一。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为具有多向分化潜能的成体干细胞，目前已成为最具前景的“种子细胞”。其不仅能够容易从骨髓中获取，且通过注射方式移植至心肌后能够分化成心肌样细胞。本课题组近期的实验研究显示携带HCN4基因的MSCs（HCN4-MSCs）同种异体移植到犬完全性房室传导阻滞模型心脏后能产生源自注射部位的自发频率，但因其频率明显低于体外诱导培养的心脏起搏样细胞的自发频率，推测移植细胞在宿主体内大量死亡可能是其频率低下的原因之一。在体动物实验研究已证实大多数移植至心脏的MSCs均在移植后的最初两天内死亡，急性炎症反应可能是移植细胞死亡的重要原因。另有研究显示MSCs体内移植后存活率为20–30%，移植细胞死亡的主要原因可能为缺血、凋亡、炎症或免疫排斥反应。由此可见，MSCs移植治疗效果因移植细胞低生存率而受到影响，而寻找防治移植细胞死亡、提高移植细胞在宿主体内存活率新方法，则有助于提高细胞移植效果。雷公藤甲素是从中药雷公藤中提取出的小分子活性物质，目前研究显示雷公藤甲素具有抗炎和免疫抑制作用，将其用于MSCs移植治疗，可能有助于抑制急性炎症反应和免疫排斥，减少移植细胞死亡、提高移植细胞在宿主体内的存活率。因此，本研究拟在行HCN4-MSCs同种异体心脏移植时，用雷公藤甲素进行干预，以探讨雷公藤甲素对移植细胞存活率的影响及可能机制。方法1.无菌条件下取健康雄性SD大鼠双侧股骨及胫骨的骨髓，经密度梯度离心法结合贴壁培养法获得MSCs，然后通过频繁的换液体外进行扩增及纯化。2.以mHCN4慢病毒载体（pMSCV-mHCN4-EGFP）转染大鼠MSCs，转染后应用杀稻瘟菌素药物加压筛选。免疫荧光法检测mHCN4及EGFP目的基因的表达情况。CCK-8法检测HCN4-MSCs的细胞增值能力。3.应用性别错配的细胞移植模型，即将雄性来源的HCN4-MSCs同种异体移植到雌性SD大鼠心脏，通过定量RT-PCR法检测雌性大鼠心脏中雄性基因Sry的表达量而得出移植细胞的存活数量。首先将已知数量且经过倍比稀释的（2.0×10~2，2.0×10~3，2.0×10~4，2.0×10~5，2.0×10~6）HCN4-MSCs体外注射入雌性大鼠心脏中通过检测雄性基因Sry的表达量得出移植细胞数量与Sry的表达量之间关系的标准曲线。4.将不同数量的HCN4-MSCs通过开胸心外膜直视下注射法以单点心肌注射方式同种异体移植到雌性SD大鼠心脏，用定量RT-PCR法检测心脏标本中Sry的表达量，根据标准曲线得出移植细胞的最佳移植数量。5.将按照最佳移植数量进行细胞移植术的雌性SD大鼠随机分为三组（每组30只大鼠）：（1）雷公藤甲素组（Tri）：大鼠腹腔内注射雷公藤甲素200μg/kg/d，共10天(术前3天至术后7天)；（2）地塞米松组（Dex）：大鼠腹腔内注射地塞米松400μg/kg/d，共10天(术前3天至术后7天)；（3）对照组（Con）：大鼠腹腔内注射无菌生理盐水(2ml/次)，共10天(术前3天至术后7天)。6.各组动物按术后观察时间点不同（术后24小时、72小时、7天、14天、28天）分为5各亚组（每个亚组6只大鼠）。于细胞移植后不同时间点采集血标本或处死动物、取出心脏，进行标本处理及以下检测。（1）对各时间点心脏标本用定量RT-PCR法检测雌性大鼠心脏标本中雄性基因Sry的表达量，根据标准曲线得出移植细胞的存活数量。（2）于术后24小时、72小时取血，以ELISA法检测血清中核转录因子NF-κB和炎症因子IL-1β, IL-6, TNF-α的蛋白表达水平。同时用RT-PCR法测定包含细胞移植区心肌组织上述相关因子mRNA的表达。（3）TUNEL法检测细胞移植区移植细胞的凋亡发生情况，免疫印迹法检测细胞移植区心肌组织凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达，膜片钳检测细胞移植区域移植细胞的起搏电流(If)。（4）细胞移植术后28天，麻醉后处死大鼠，细胞移植区心肌组织应用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后切片，利用免疫组化的方法检测心肌特异性标志物肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）及缝隙连接蛋白43（connexin43, CX43）的表达。结果1.分离培养出的第二代MSCs紧贴于培养瓶壁上，外观呈纺锤形或多角形。流式检测结果显示骨髓间充质干细胞抗原CD29和CD90呈阳性表达，抗原CD45呈阴性表达。2.成功地将携带mHCN4基因的慢病毒载体（pMSCV-mHCN4-EGFP）转染至大鼠骨髓MSCs。在MOI=10的条件下，转染效率约为67%，抗生素筛选后阳性率可达90%以上。免疫荧光染色证实转染后的细胞稳定表达mHCN4及EGFP蛋白。CCK-8法检测结果显示转染mHCN4后的骨髓MSCs呈现较强的增值能力。3.体外将雄性来源且倍比稀释(2.0×10~2,2.0×10~3,2.0×10~4,2.0×10~5及2.0×10~6)的HCN4-MSCs分别移植入雌性大鼠心肌中，定量RT-PCR技术检测标本中Sry的表达量，得出移植细胞数量与Sry基因表达量的间关系的标准曲线。4.应用性别错配的移植模型将不同数量的HCN4-MSCs同种异体移植到雌性大鼠心脏中，移植后72小时定量RT-PCR法检测心脏标本中Sry的表达量，根据标准曲线得出移植细胞的存活数量。结果显示1×10~6为细胞同种异体心脏移植单点心肌注射的最佳移植数量。5.选取1×10~6为移植细胞数量，雷公藤甲素治疗组HCN4-MSCs心肌内移植后24小时、72小时、7天、14天及28天，移植细胞的存活率分别为29.27±0.93%、17.55±1.24%、7.37±0.34%、4.15±0.38%及3.40±0.14%；均显著高于相同时间段对照组的细胞存活率14.74±0.94%、6.90±0.19%、3.17±0.16%、1.41±0.40%和0.76±0.36%（各时间段P＜0.01）。地塞米松干预组在相同时间段细胞的存活率分别为28.17±1.76%、15.63±0.36%、6.08±0.26%、3.38±0.32%和2.55±0.12%；也显著高于对照组的细胞存活率（n=4/组/时间点，各时间段P＜0.01）。6.直接心肌注射可引起机械性损伤随后产生急性炎症反应，引起移植细胞的死亡。雷公藤甲素具有抗炎作用，能够降低核转录因子NF-κB和IL-1β, IL-6及TNF-α三种炎症因子的表达水平。短期应用雷公藤甲素干预治疗能够提高HCN4-MSCs心肌内移植后的存活率。7.雷公藤甲素干预治疗可减少移植细胞的凋亡发生率，降低移植区域促凋亡蛋白Bax的表达但升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。8.膜片钳检测结果示HCN4-MSCs心肌内移植后在宿主心脏中存活4周以上并可记录到被CsCl可逆性阻断的超极化激活的起搏电流(If)。雷公藤甲素干预治疗对移植细胞的功能无不良影响。9.免疫组化检测结果显示部分HCN4-MSCs心肌内移植后4周既表达EGFP又表达心肌特异性标志物cTnT或缝隙连接蛋白CX43，提示HCN4-MSCs心肌内移植后分化为新的心肌样细胞。结论1.不同数量雄性来源的HCN4-MSCs应用性别错配的移植模型同种异体移植到雌性大鼠心脏中，定量RT-PCR检测Sry基因表达量，根据标准曲线得出各组移植细胞的存活数量，结果示1×10~6为细胞同种异体心脏移植单点心肌注射的最佳细胞移植数量。2.雷公藤甲素干预治疗可提高HCN4-MSCs心脏移植后的存活率。其机制可能为直接心肌注射引起机械性损伤并产生急性炎症反应引起移植细胞的死亡，雷公藤甲素具有抗炎作用，能有效地抑制核转录因子NF-κB及炎症因子IL-1β, IL-6及TNF-α的释放，减轻炎症反应。3.雷公藤甲素对移植细胞的功能无不良影响，HCN4-MSCs心肌内移植后可记录到起搏电流(If)；部分HCN4-MSCs心脏移植后4周表达EGFP及心肌特异性标志物cTnT或缝隙连接蛋白CX43，支持移植入心肌的HCN4-MSCs分化为新的心肌样细胞。