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竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Heen)是短穗竹属(Brachystachyum densiflorum Keng)等竹子上的病原真菌,其子实体(中药-竹黄)中主要成分竹红菌甲素(hypocrellin A,HA)是一种具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒等活性的苝醌类光敏化合物。野生竹黄产量低,因此常利用其无性菌丝培养进行竹红菌素的生产。目前,一氧化氮(NO)信号在真菌中研究逐渐开始增多,NO可以参与调控如孢子萌发、子实体的发育和菌丝的生长,也是调节真菌次生代谢的重要的细胞信号。本研究通过添加外源NO供体来提高竹红菌素的合成,并进一步通过转录组水平深入研究NO对竹红菌素合成的调控机制,为竹红菌素的生物技术生产调控提供有效方法,为竹红菌素的次生代谢调控提供理论基础和参考。主要研究如下:(1)通过筛选外源NO硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)不同浓度和在竹黄菌培养中的不同加入时间,优化了NO的最佳诱导条件为:在竹黄菌液体发酵培养第3天添加0.02 mM SNP,菌丝内HA的含量提了 2.78倍,同时也促进了 HA向胞外的转运,总产量达到了对照组的2.27倍,为89.66 mg/L。(2)通过测定SNP诱导后的生理生化指标,表明NO对残糖、pH影响并无显著影响。其次,添加SNP不影响菌落形态,但显著抑制了孢子数量,NO处理下,孢子数量与对照相比降低了 55%,并呈剂量相关性。竹黄菌孢子在9小时开始膨大并出芽,随着时间胚芽管伸长,在24小时出现侧枝,在36小时菌丝缠绕。SNP处理下测定了9、12、15小时孢子萌发率分别降低了 42%、36%、45%,表明SNP抑制了孢子萌发。此外,SNP刺激后菌团直径变小,菌丝粗糙,胞内色素明显积累并释放到胞外。(3)基于转录组测序,共得到24804条unigene序列。通过对处理组和对照组的基因差异表达水平分析,得到571条差异基因(DEGs),其中355条上调,216条下调。进一步通过 GO 功能分析发现 ’ transport(GO:0006810)’、‘membrane(GO:0016020)’、‘integral to membrane(GO:0016021)’、‘intrinsic to membrane(GO:0031224)’、‘membrane part(GO:0044425)’和、‘oxidoreductase activity(G0:0016491)’等条目有显著富集。(4)ROS荧光探究检测到活性氧迸发,H2O2和O2-的水平都显著增加,在处理第7天时分别上升1.71倍和1.59倍。NADPH氧化酶(NOX)酶活性不断增加,酶基因表达约为对照组水平的3.71倍。抗氧化酶系中过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶活力上升,酶基因表达上调是对照同期水平的1.85和1.64倍。表明SNP诱导后竹黄菌内大量ROS产出,从而形成氧化胁迫促进竹红菌素合成积累增加。(5)研究了 SNP对竹黄菌中跨膜转运的作用,结果显示SNP可以显著促进30条 MFS(major facilitator superfamily)转运蛋白和 2 条ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白编码基因的表达上调。另外,不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比值的显著升高,进一步用高亲和力核酸染色荧光染料(SYTOX Green)表明竹黄菌细胞膜通透性增加,从而使竹红菌素向胞外分泌。(6)研究了 SNP调控竹红菌素的合成,利用转录组技术分析了与竹红菌素合成相关的DEGs,包括3条聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因,5条O-甲基转移酶(o-methyltransferase,Omef)基因,15 条单氧酶(monoxygenase,Mono),3 条FAD 氧化还原酶(FAD/FMN-dependent oxidoreductase,FAD),2 条多铜氧化酶(multicopper oxidase,MCO),30 条 MFS(major facilitator superfamily)转运蛋白和 2条ABC(ATP-bindingcassette)转运蛋白编码基因。另外也影响了与色素生物合成相关的细胞色素P450蛋白质家族。本研究优化了外源SNP诱导竹黄菌菌丝培养生产竹红菌素的培养条件,NO促进了菌丝胞内HA的积累和胞外转运,使菌丝培养HA生产提高了 2.27倍。我们结合了显微观察、生理指标测定和q-RTPCR和转录组分析,探讨了 SNP对竹黄菌菌丝生长和HA生物合成的影响,发现NO可以抑制孢子萌发和菌团大小,改变菌丝氧化还原态、促进膜转运基因表达,促进竹红菌素合成基因簇内关键酶基因的表达,从而诱导竹红菌素的积累。该研究为竹红菌素的菌丝培养生产提供了调节方法和途径,为NO对真菌次生代谢的合成调控提供了理论基础和参考。