Dynamin(发动蛋白)是一类具有鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性的超家族蛋白,可以影响膜重构(membrane remodeling),在细胞内吞、膜泡运输、膜分裂融合等过程中发挥关键作用。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)隶属节肢动物门(Arthropod)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae),是我国具有经济价值的蟹类养殖品种之一。雄性中华绒螯蟹精子发生过程涉及细胞质胞吐、核形变、顶体形成等事件,Dynamin在这一多步骤的细胞分化过程中的表达、分布特征及所发挥的功能尚不明确,值得深入探讨。本研究利用分子生物学、细胞生物学等技术方法,分析Dynamin蛋白在雄性中华绒螯蟹精子发生过程中的表达特征及该家族蛋白对精子形态、顶体发生的影响和可能存在的作用机制。研究结果为Dynamin家族蛋白在中华绒螯蟹精子发生过程中的表达特征提供了理论数据;为揭示Dynamin蛋白在中华绒螯蟹雄性生殖细胞发育过程中的作用奠定基础;也为该家族蛋白在其他甲壳动物中的相关研究提供借鉴。通过免疫印迹、免疫荧光技术探究经典Dynamin(Dyn1,Dyn2,Dyn3)在中华绒螯蟹精子发生的各个时期的表达及动态分布特征。结果表明,经典Dynamin表达于中华绒螯蟹生殖细胞中:在精子发生不同时期与顶体反应后的精子中Dyn2、Dyn3一直存在,而Dyn1只在成熟精子和发生顶体反应后的精子中被定位到;与Dyn3不同的是,Dyn1和Dyn2不仅存在于发生顶体反应后精子的头帽结构中,而且在顶体管尖端也有分布。从中华绒螯蟹精巢组织转录组数据库中获得类Dynamin蛋白(Dynamin-like protein,DLP)序列,生物信息学分析确定其属于Dynamin蛋白家族;利用分子克隆技术,构建DLP的表达载体并经原核表达纯化相应蛋白;利用多克隆抗体制备技术获得DLP多克隆抗体(Polyclonal antibody DLP,PcAb-DLP);免疫荧光定位分析显示,在中华绒螯蟹精子发生过程中,DLP存在于精原细胞、精母细胞、精细胞、精子中;免疫电镜结果显示,DLP分布于成熟精子顶体的头帽结构、顶体囊丝状层、中间层、片层结构,以及顶体管中。利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,经活体注射siRNA,通过实时荧光定量PCR分析中华绒螯蟹DNM基因表达量的统计学差异,发现在注射24 h时DNM基因的表达量被显著抑制;免疫印迹、免疫荧光结果显示,经RNAi后,中华绒螯蟹生精细胞中Dynamin家族蛋白的表达量降低;敲低DNM基因的表达后,半薄切片分析发现,从精原、精母至精细胞时期无法观察到染色质从分散到凝集的状态变化;大量精子结构“畸形”;透射电镜观察,精子整体结构松散,细胞内各膜相结构之间界限不清,核膜与膜复合体被破坏;顶体管形态不完整,头帽结构松散,导致无明显顶体结构。由此说明,Dynamin蛋白参与调节中华绒螯蟹的精子发生过程、稳定顶体结构。