第一部分 二氯乙酸和硼替佐米对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的联合作用研究背景多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一组以骨髓内单克隆浆细胞克隆性增殖为特征的血液系统恶性肿瘤。克隆性浆细胞直接浸润组织和器官及其分泌的M蛋白导致临床上的各种症状,其中以贫血、骨骼疼痛或溶骨性骨质破坏、高钙血症和肾功能不全为特征。在过去几十年间,MM的治疗有很大进展。新型药物如蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)、免疫调节剂沙利度胺等能显著改善MM患者的预后。其中,硼替佐米(PS-341)是第一个用于临床的蛋白酶体抑制剂,现已广泛用于复发以及初诊的MM患者。然而,部分MM病人并无法由此药获益,有些开始对硼替佐米治疗起效的病人最终也形成治疗抵抗。因此,探索能与硼替佐米联用的治疗方案是增强药物疗效、减少药物副作用从而延长MM病人生存率的重要措施。最近,在基础与转化研究方面的许多进展增强了人们对MM发病机制的理解,促进了新型与更有效的治疗方案的发展。此前已证实,包括MM在内的肿瘤细胞在氧气充足的环境下倾向于通过无氧代谢获取能量,这种作用机制称为Warburg效应(Warburg effect)。而凋亡抵抗是无氧代谢产生的生存优势的一种,阻断肿瘤无氧代谢能有效抑制肿瘤生长。二氯乙酸(Dichloroacetate,DCA)是人工合成的一种无氧代谢抑制因子,能通过特异性抑制糖酵解途径中的丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)活化丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH),从而促进代谢从细胞质丙酮酸转化为线粒体乙酰辅酶A。因此,DCA可通过抑制无氧糖酵解向有氧代谢转化减少细胞对凋亡的抵抗。因此,无氧代谢抑制剂DCA可能作为与硼替佐米联用治疗多发性骨髓瘤治疗的新型手段。研究目的:明确无氧代谢抑制剂二氯乙酸对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株增殖和凋亡的影响,评估DCA与蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合应用时的抗肿瘤效果,明确二者联合应用时参与的分子机制。研究方法:1、细胞培养:体外培养MM RPMI8226细胞株,取对数生长期细胞进行实验。CCK-8方法分别检测DCA及硼替佐米在不同浓度时对MM RPMI8226细胞株增殖的影响,以确定最佳联合用药浓度。2、BrdU染色方法检测不同药物处理对细胞增殖的影响:培养MM RPMI8226细胞株,并分别给予DCA、硼替佐米单药或联合处理,BrdU染色后用流式细胞仪检测不同处理组对MM细胞增殖的影响。3、Annexin V-FITC/PI染色检测不同药物处理对细胞凋亡的影响:培养MM RPMI8226细胞株,并分别给予DCA、硼替佐米单药或联合处理,Annexin V-FITC/PI染色后用流式细胞仪检测不同药物处理对细胞株凋亡的影响。4、Elisa检测不同药物处理对细胞乳酸表达水平的影响:培养MM RPMI8226细胞株,并分别给予不同药物处理,随后以乳酸检测试剂盒检测不同药物处理后MM细胞乳酸表达水平的变化。5、CM-H2DCFDA探针检测不同药物处理对细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)表达水平的影响:培养MM RPMI8226细胞株,并分别给予DCA、硼替佐米单药或联合处理,加入荧光探针CM-H2DCFDA后用流式细胞仪检测不同药物处理后ROS表达水平变化。6、Western blot检测细胞HIF-1α、pPDH-E1α(Ser-293)、PDH-E1α(Ser-293)蛋白表达变化:培养MM RPMI8226细胞株,并分别给予不同药物处理,提取蛋白并测定蛋白浓度,蛋白质印迹法检测不同药物处理后乏氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、磷酸化的丙酮酸脱氢酶-E1α(Pyruvate dehydrogenase-E1αphospho S293,pPDH-E1α)、丙酮酸脱氢酶-E1α(Pyruvate dehydrogenase-E1α,PDH-E1α)蛋白表达的差异。研究结果:1、DCA及硼替佐米均能抑制MM RPMI8226细胞株的增殖,DCA 20mM及硼替佐米5nM时抑制作用明显,抑制率均为30%左右,抑制效率相近(p<0.05),适合作为联合用药组使用。2、DCA能明显抑制MM RPMI8226细胞株增殖,周期阻滞在G0/G1期,促进MM细胞的凋亡;且DCA能显著增加了MM对硼替佐米的敏感性。3、DCA能明显改变MM RPMI8226细胞株的代谢,促进代谢从无氧糖酵解向氧化磷酸化转变。这一转变与HIF-1α降解,pPDH-E1α减少,乳酸生成减少和ROS产生增加有关。结论:无氧代谢抑制剂DCA能有效抑制MM RPMI8226细胞株的增殖,促进其凋亡,并且DCA与硼替佐米联用时增加了MM细胞株对硼替佐米的敏感性。这一对MM细胞株的抑制作用可引起无氧代谢产物乳酸生成减少,有氧代谢产物ROS生成增加,并与HIF-1α、PDH-E1α等代谢调控蛋白的表达降低有关。第二部分二氯乙酸与硼替佐米在多发性骨髓瘤小鼠模型中的联合作用研究背景:多发性骨髓瘤是一种恶性浆细胞肿瘤,占所有血液系统恶性肿瘤的10%-15%。目前,多发性骨髓瘤的治疗有多种方案,包括传统化学治疗、造血干细胞移植和现代药物等。硼替佐米为蛋白酶体抑制剂,体外试验证明硼替佐米对多种类型的肿瘤细胞具有细胞毒性。临床前肿瘤模型体内试验证明硼替佐米能够延迟包括多发性骨髓瘤在内的肿瘤生长,目前已广泛用于MM治疗。然而单药应用时仍有部分病人不能完全缓解,或最终复发。无氧代谢抑制剂二氯乙酸(DCA)是一种PDH调控因子PDK的特异性抑制因子,能有效促进丙酮酸的线粒体氧化。此前我们已证实,DCA与硼替佐米在体外的联合应用能显著提高硼替佐米在多发性骨髓瘤细胞的效用,但二者联合在动物体内的作用及具体效应机制尚需进一步研究。研究目的:探索DCA联合硼替佐米在多发性骨髓瘤小鼠体内中的作用,观察联合用药在小鼠模型体内的一般情况,明确联合用药时起作用的分子机制,为二者在多发性骨髓瘤病人体内的联合应用提供理论与临床前证据。研究方法:1、荷瘤小鼠模型建立:体外培养多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226,在细胞对数生长期时将细胞接种到非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(Non-Obese Diabetes/Severe Combined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠皮下,建立多发性骨髓瘤荷瘤小鼠模型。2、观察小鼠一般状态,包括小鼠精神状况、活动度、皮肤状况、饮食饮水量等;监测骨髓瘤瘤体生长情况,定期测量瘤径。3、分组药物处理:小鼠随机分组,分别予以DCA、硼替佐米、DCA+硼替佐米处理,继续观察小鼠一般情况,定期测量瘤径。4、免疫组化分析:药物处理一定时间后处死小鼠,称量小鼠体重,剥离瘤体并进行免疫组织化学染色,检测肿瘤组织HIF-1α、p PDH-E1α、PDH-E1α蛋白的表达及定位。研究结果:1、成功建立人NOD/SCID多发性骨髓瘤小鼠模型。接种7-14天后,小鼠左腹股沟部出现可触及肿块。2、DCA与硼替佐米联用时能增强对骨髓瘤生长的抑制作用,提高了多种疾病指标。3、小鼠肿瘤的免疫组织化学染色结果提示DCA与硼替佐米联合作用的分子机制与HIF-1α降解与p PDH-E1α减少有关。结论:无氧代谢抑制剂DCA与硼替佐米联合应用于多发性骨髓瘤小鼠模型后,能有效抑制肿瘤在小鼠体内的增殖速度,提高了多种疾病预后指标,总的来说,我们的数据为DCA与硼替佐米的联合应用提供了新思路,为二者在多发性骨髓瘤病人中的联合应用提供了实验依据。