研究背景近年来,液体活检技术在新型肿瘤标志物临床检测应用中取得了突破性进展。其主要通过各种技术方法检测肿瘤原发灶或转移灶释放到外周血或其他体液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)或者外泌体,从而达到诊断或监测肿瘤的目的。线粒体是几乎存在于所有真核细胞中的重要细胞器,参与许多生命活动的调节。线粒体DNA(mitochondria DNA,mt DNA)是一段双链闭合环状结构,包括编码区和非编码区,全长仅有16569bp,测序产生的数据量小,所以检测快速、成本低。mt DNA具有高拷贝数,一个细胞中可含有几百至几千个mt DNA的拷贝。另外,肿瘤细胞中mt DNA常存在于高水平活性氧的环境下,同时缺少组蛋白保护和有效的DNA修复系统,因此其突变频率较核基因组高10倍左右。因此,外周血游离mt DNA作为诊断、治疗标志物具有良好临床应用价值,有望成为液体活检的新型肿瘤标志物。目的1.分析血浆游离线粒体DNA特征,包括血浆游离mt DNA拷贝数、片段大小和断点分布;2.建立肿瘤患者血浆游离mt DNA突变的大样本精准检测方法;3.观察肿瘤患者血浆游离mt DNA突变特征,并探索可能在肿瘤发生及演变过程中可能发挥重要功能的mt DNA突变。方法1.构建全基因组测序文库,通过全基因组测序分析血浆游离mt DNA的拷贝数、片段分布特征及断点特征;2.利用自制的线粒体DNA杂交捕获探针从全基因组测序文库中捕获mt DNA,观察不同探针使用量、探针长度、杂交温度以及扩增次数对于mt DNA富集效率的影响,以优化mt DNA检测的实验流程;3.使用上述优化后的流程对肿瘤患者中血浆游离mt DNA进行捕获,利用自建的生信分析流程检测血浆游离mt DNA体细胞突变,并分析突变特征。结果1.肝癌血浆游离mt DNA的拷贝数显著低于组织mt DNA(P<0.001);片段分布集中于100-140bp之间,明显低于血浆游离DNA,断点呈现规律性分布;2.捕获效率随探针使用量的增加呈先上升后下降的趋势,探针长度、杂交温度以及扩增次数对于捕获效率均有影响,通过设置不同实验参数,已建立最优流程;3.肿瘤患者的血浆中mt DNA异质性突变数量高于肿瘤组织中mt DNA异质性突变数量(P<0.05);4.肿瘤患者的血浆与肿瘤组织样本中存在相同的mt DNA异质性突变。结论血浆中mt DNA与肿瘤组织中mt DNA存在差异性,应个性化设置实验参数以提高捕获效率;基于靶向捕获测序技术,可以准确的在血浆中检测到肿瘤来源的mt DNA突变。