目的：　　肝细胞癌（hepatocellular caricinoma，HCC，以下简称肝癌）是我国常见恶性肿瘤之一，尽管肝癌的诊断与治疗已取得许多进展，但由于其起病隐匿，早期症状不明显，患者在确诊时往往已失去手术切除或肝移植等根治性治疗的机会，因此肝癌的预后不容乐观，肝癌的研究任重道远。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类发挥转录后调控效应的内源性单链非编码RNA。它可通过一系列信号传导相关通路在肿瘤的发病过程中的各个环节发挥功能。miRNA可直接通过对其靶基因的调控发挥其生物学作用，也可与其他的miRNA共同形成miRNA-miRNA调控网络发挥其生物学功能。研究表明miRNA在肝癌的发生、发展及预后中扮演着重要的功能。其中miR-195与肿瘤关系密切，它有两种成熟的表现形式，miR-195-3p及miR-195-5p，分别为miR-195的3端和5端，两者序列不同，作用也有所不同，后面所提到的miR-195为二者的总称。关于miR-195在肝癌中的研究，目前国内外已有的结论如下：miR-195在肝癌中作为抑癌基因存在，其在肝癌中表达下调；其表达水平与肝癌肿瘤的大小呈反相关关系，肿瘤负荷越大，miR-195表达水平越低；它可以LATS2为靶点来调节肝癌细胞的凋亡。但是关于miR-195在肝癌的发生发展中发挥的具体的作用机制仍不甚清楚，它在具体肝癌发生中哪些环节发挥作用，它是否与肝癌的预后相关，它是否可以作为肝癌的生物学标志物来对待，它是否还与一些其他的miRNAs在肝癌的发生发展中起到了协同作用，是否存在其他与肝癌预后相关的miRNAs。本课题将进一步深入研究miR-195、其它分子及其相关靶基因与肝癌的关系。本课题设计将分为三部分进行，第一部分主要阐述miR-195在肝癌发生发展中的重要性，第二部分详细讨论其在肝癌中具体发挥的功能及其参与的生物学作用。前两部分是通过生物信息学方法阐述了miR-195及其他分子（如下面要提到的miR-34c和miR-139）还有其所调控的靶基因在肝癌中所参与的重要作用，第三部分针对前两部分的一些结果我们进行实验验证以证实其可靠性。　　本课题将利用从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库下载miRNA测序数据和mRNA的测序数据，以及肝癌患者的临床数据，还有miR-195过表达的肝癌HepG2细胞转录组测序数据，对这些数据进行处理，进一步通过差异分析、富集分析、miRNA靶基因预测、生存分析等生物信息学手段，分析肝癌与癌旁组织不同的miRNA及mRNA表达模式，进行miRNA-mRNA调控网络分析，构建miRNA-miRNA的共调控网络，分析关键miRNA和靶基因对肝癌的作用及预后影响。结合miR-195的靶基因信息，重点分析miR-195的功能。并进行实验验证，以证实本课题的可靠性。从而探索miR-195过表达之后对肝癌的发生、发展及预后的影响，为阐明肝癌的发病机制及探讨miR-195在肝癌的发生发展中具体参与的作用奠定理论基础。　　方法：　　1. 下载TCGA数据库的mRNA、miRNA测序数据和肝癌患者的临床数据，使用R包进行预处理，筛选出差异miRNA和差异mRNA，对差异mRNA进行GO、pathway富集分析、miRNA-mRNA调控网络分析、miRNA共调控网络和功能协同分析，并对关键miRNA功能分析，重点关注miR-195所发挥的作用，并对差异miRNA和mRNA进行肝癌的预后分析等。　　2. 从GEO数据库下载miR-195过表达的肝癌HepG2细胞转录组测序数据，进行数据处理，差异基因识别及差异分析，获得miR-195过表达后显著差异表达的基因，对这些基因进行GO富集分析，包括BP（Biological Process）、CC（Cellular Component）、MF（Molecular Function）分析和kegg pathway富集分析、蛋白质相互作用网络分析（protein protein interaction network，PPI）、网络模块分析、miRNA-TF-mRNA调控网络分析等。　　3. 基于公共数据库的分析结果，我们进一步对部分差异基因（PAPGEF3、POU3F2、LDB3、HOXA7、FBX032）进行实验验证。培养肝HepG细胞，利用化学合成的miR-195寡核苷酸类似物miR-195 mimic转染HepG2细胞，上调其中miR-195的表达，并与空白对照组（NC组）比较，转染后的细胞培养于DMEM培养基中，并进一步利用实时荧光定量核酸扩增检测系统（QPCR）检测上述5个靶基因的表达水平。采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，应用两独立样本t检验进行组间差异比较，同时应用Graphpad prism制图软件使得结果更加直观。　　结果：　　1. 在TCGA肝细胞癌数据集中，我们下载mRNA、miRNA测序数据和肝癌患者的临床数据（包括年龄、性别、种族、肿瘤分期、生存时间等），并对数据进行了预处理，同时满足mRNA、miRNA 测序数据和临床数据齐全的样本有366个。通过差异表达分析，获得了1214个差异基因（其中318个上调基因，833个下调基因）和62个差异miRNA（其中20个上调，42个下调）。1.通过差异mRNA功能通路分析，发现上调基因显著富集在细胞周期（Cell cycle）、卵母细胞分裂（Oocyte meiosis）、p53 信号传导等通路中，说明上调基因涉及肿瘤细胞的增殖、细胞凋亡、DNA修复等功能；下调基因主要富集在视黄醇代谢，化学致癌作用，细胞色素P450等代谢通路上，这与肝癌进展中导致的肝功能受损相关。2.miRNA-mRNA调控网络分析发现，该网络中受miR-195-5p和 miR-195-3p调控的靶基因共11个，说明miR-195参与的生物学作用较多，在肝癌的发展中占据重要位置。3.通过绘制K-M生存曲线，生存分析获得了80个潜在的预后相关基因mRNA和2个预后相关miRNA，即miR-34c和miR-139（其中前者在肝癌组表达上调，且其表达水平越高，患者预后越差，说明miR-34c可作为肝癌预后不良的指标；miR-139在肝癌组表达水平下调，且其表达水平越低，患者预后越差，说明miR-139可作为肝癌预后良好的指标对待）。4.通过miRNA共调控和功能协同分析，确定了多个差异miRNA可能参与的功能，并发现miR-195在共表达网络中处于中心位置，是调控网络中的重要节点。5.通过对关键miRNA功能分析，发现miR-195参与了P53信号传导通路、细胞周期、PI3K细胞传导通路、mTOR信号传导通路、病毒相关的肿瘤形成等生物学过程。　　2. 在GEO数据库下载的miR-195过表达的肝癌HepG2细胞数据集GSE41074中，采用倍数变化法进行差异基因识别，得到差异基因464个（其中上调基因331个，下调基因133个）。1.通过差异表达功能的基于富集分析，发现其中上调基因显著富集在细胞粘附相关功能、细胞凋亡、细胞迁移等相关通路上，下调基因富集到硫酸乙酰肝素蛋白多糖生物合成过程，与B细胞增殖的正调节有关。2.蛋白质相互作用网络分析（PPI）发现，TTR、COL1A1、NGFR、ZBTB47等是网络中的关键性蛋白。3.进一步的网络模块分析结果认为，miR-195通过其一系列靶基因参与肝癌细胞的凋亡、细胞增殖等生物过程，还在肝癌的氧化还原相关生物过程、免疫反应、细胞骨架等环节发挥作用，其中后三方面的作用在以往的研究中是没有涉及的，即本课题首次提出miR-195在肝癌的氧化还原、免疫反应及细胞骨架等方面的作用。4.miRNA-TF-mRNA调控网络分析，利用miRWALK数据库的miRNA靶基因预测功能，我们最终得到了miR-195的77个差异靶基因，其中上调基因52个，下调基因25个。这些差异基因可能直接受miR-195 的调控，主要功能富集在细胞骨架、细胞增殖等相关的生物过程。将miRNA-mRNA和miRNA-TF-mRNA合并，得到总的miRNA-TF-mRNA调控关系网络。前两部分是通过生物信息学方法阐述了miR-195及其他分子（如miR-34c和miR-139）以及其靶基因在肝癌中所参与的重要作用，后续第三部分我们会对前两部分的一些结果进行实验验证以证实本课题的可靠性。　　3. 利用miR-195 mimic转染HepG2细胞，上调其miR-195的表达，并与空白对照组比较，通过QPCR分析发现，PAPGEF3、POU3F2、LDB3、FBX032表达水平显著上调（差异具有统计学意义），与公共数据分析结果一致，这四种基因均为miR-195的上调靶基因；而HOXA7的表达水平与miR-195的过表达则没有相关性，不受miR-195的影响。本部分进一步验证了生物信息学部分的可靠性。　　结论：　　1.miR-195通过其靶基因参与肝癌的细胞凋亡、细胞迁移、细胞粘附、氧化还原、细胞增殖、免疫反应、细胞骨架形成等生物学进程，是肝癌发生发展过程中的重要分子。　　2.miR-195在肝癌中表达下调，但是生存分析发现其与肝癌的预后没有相关性。而miR-34c和miR-139则与肝癌的预后相关，miR-34c表达水平越高，肝癌患者预后越差；miR-139表达水平越低，肝癌患者预后越差。　　3.miR-195及其他相关分子在肝癌的发生发展及预后中发挥重要作用。