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研究目的异烟肼(INH)和利福平(RFP)是两种主要的一线抗结核药物,在结核病的治疗过程中常联合使用,能够有效的治疗结核杆菌感染引起的结核病。但是,大量的临床实验研究及动物实验研究结果显示,异烟肼和利福平在联合使用过程中会导致部分患者产生严重的药物性的肝损伤,甚至是肝衰竭,严重威胁着患者的生命健康安全；同时,异烟肼和利福平所引起的药物性的肝损伤又会致使药物治疗中断,引起药物的不规范使用,导致抗药性结核杆菌和耐药性肝损伤的发生,严重阻碍了结核病的预防和控制。异烟肼和利福平所致肝损伤的机制尚未完全明确,目前的研究大部分认为与氧化机制有关,也有部分研究发现异烟肼有免疫抑制性,可以引起肝脏组织内的免疫系统的紊乱,加剧肝脏组织内的损伤。三硫二丙烯(DATS)作为一种大蒜制品,含有丰富的抗氧化活性成分,并且具有广泛的药理作用,如提高免疫力,抑制炎症反应等。已有研究表明了三硫二丙烯能够有效预防多种药物如酒精、四氯化碳、砷等引起的肝脏损伤,但是其对异烟肼和利福平联合所致肝损伤的保护效果国内外尚未见报道。本次研究通过参考国内外大量相关研究的文献,连续10天以灌胃的方式给予昆明小白鼠异烟肼和利福平的混合生理盐水溶液来建立异烟肼和利福平的小鼠肝脏损伤模型,并设立低、中、高三个剂量的三硫二丙烯进行保护性地干预研究,通过测量血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)等的活性和总胆红素(T.BILI)的含量指标,以及观察肝脏组织病理学切片,来研究三硫二丙烯是否具有预防异烟肼和利福平联合所致肝损伤的效果,同时,通过测量肝脏组织内的谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量水平,肝脏组织内的细胞因子白细胞介素(IL-1β),促炎性因子肿瘤坏死因子(TNF-a)的分泌含量以及免疫组化染色法观察枯否细胞(KCs)的活化情况和采用小鼠碳颗粒吞噬实验来检测小鼠的免疫能力,来探讨其可能的氧化抗氧化机制以及免疫机制,为以后的体内外的研究及临床应用提供实验依据。研究方法1、动物的处理方法雄性昆明小鼠共120只(SPF,20-22g),完全随机的分为六组：空白对照组、INH/RFP处理组、DATS低剂量联合处理组、DATS中剂量联合处理组、DATS高剂量联合处理组、DATS对照组。每组20只,于每日上午9点以灌胃的方式给予DATS低剂量联合处理组、DATS中剂量联合处理组、DATS高剂量联合处理组及DATS对照组相应浓度的DATS(10、20、40和40 mg/kg bw),同时给予空白对照组,INH/RFP处理组等体积的玉米油；2小时后,同样以灌胃的方式给予INH/RFP处理组及DATS低剂量联合处理组、DATS中剂量联合处理组、DATS高剂量联合处理组INH/RFP的混合生理盐水溶液(100+100mg/kg bw),同时给予空白对照组和DATS对照组等体积的生理盐水。持续的灌胃给药处理10天后,每组随机的取10只小鼠进行常规麻醉后,采用眼球摘除法取血,于4℃1500×g离心20分钟,收集血清；同时剥离肝脏并称重,取肝脏的同一部位肝组织固定于中性福尔马林中,将剩余的肝组织置于液氮中进行快速冷冻后置于-80℃中进行储存。剩余10只小鼠通过尾静脉注射印度墨汁(ⅰ.ⅴ.)进行碳颗粒吞噬实验以测量小鼠的吞噬能力。2、三硫二丙烯对异烟肼和利福平所致小鼠肝损伤的保护效果评价记录终末体重值,肝重值并计算肝脏系数；测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰胺转移酶(GGT)的活性水平以及总胆红素(T.BILI)的含量指标,以及ALT/GGT活性水平的比值；常规病理切片苏木素-伊红染色(H&E染色),观察肝脏肝损伤状态。3、三硫二丙烯保护异烟肼和利福平所致小鼠肝损伤的氧化抗氧化机制研究测量肝脏组织内的还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、总谷胱甘肽(T-GSH)的含量,以及丙二醛(MDA)的含量水平。4、三硫二丙烯保护异烟肼和利福平所致小鼠肝损伤的免疫机制研究采用碳颗粒吞噬实验方法测量小鼠体内吞噬细胞的吞噬能力；肝脏免疫组化切片观察枯否细胞活化水平；测量肝脏组织内的细胞因子IL-1β,促炎性因子TNF-a的分泌水平。5.统计处理方法采用的是SPSS Statistics 18.0统计软件的One-way ANOVA方法进行数据分析处理,并进行组间的两两比较分析,当P<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果1、血清中的AST、 ALT活性以及T.BILI水平的变化情况与空白对照组比较,INH/RFP处理组小鼠血清中ALT(P<0.01)、 AST(P<0.05)的活性以及T.bili (P<0.01)的水平明显升高：ALT从45.98±6.79上升至123.5±15.89U/L,P<0.01;AST从100.44±14.89上升到191.85+40.89U/L,P<0.05; T.Bili从0.38+0.71 μmol/L提高到11.36+2.78 μmol/L, P<0.01, GGT (P<0.01)水平显著降低,但ALT/GGT比值升高,差异具有统计学意义。DATS对照组未见统计学差异；与INH/RFP处理组比较,DATS低剂量联合处理(PALT、GGT<0.05)、中剂量联合处理(PALT、GGT<0.01, PT.bili<0.05)、高剂量联合处理(PAST、GGT<0.01, PAST、T、bili<0.05)、剂量联合处理组活性水平有明显改善,并具有一定的剂量反应关系。2、肝脏组织的病理变化情况小鼠肝脏H&E染色结果显示,与空白对照组相比,INH/RFP处理组肝脏出现肝损伤,主要表现为肝脏组织内的出现大量的大而圆的空泡细胞及细胞坏死,肝组织正常形态结构消失；DATS对照组未见明显差异。DATS低剂量联合处理、中剂量联合处理、高剂量联合处理组出现明显的改善。3、肝脏内GSH和MDA水平变化情况与空白对照组相比,INH/RFP处理组肝脏组织内的T-GSH和GSH的含量分别降低了31%(P<0.05),55%(P<0.01),GSSH的含量升高了103%(P<0.01), DATS对照组未见统计学差异；DATS低剂量联合处理、中剂量联合处理、高剂量联合处理组水平有明显的改善：与INH/RFP处理组比较,T-GSH含量分别升高了17%、20%,45%(P<0.05),GSH含量分别升高了61%(P<0.01)、76%(P<0.01)、133%(P<0.01), GSSH含量分别降低了26%(P<0.05)、38%(P<0.05)、40%(P<0.01)。MDA水平是肝脏脂质过氧化损伤强度的主要指标。与空白对照组相比,INH/RFP处理组肝脏组织内的MDA的含量明显升高164%(P<0.01), DATS对照组未见统计学差异；与INH/RFP处理组比较,DATS低剂量联合处理、中剂量联合处理、高剂量联合处理组MDA含量明显降低47%(P<0.05),56%(P<0.01),59%(P<0.01)。4、小鼠碳颗粒吞噬实验结果与空白对照组相比,INH/RFP处理组小鼠碳颗粒吞噬能力下降了39%(P<0.01), DATS对照组未见统计学差异；而DATS低剂量联合处理、中剂量联合处理、高剂量联合处理组小鼠碳颗粒吞噬能力明显比INH/RFP处理组升高了62%,67%,79%(P<0.01)5、肝脏组织内的枯否细胞活化水平变化情况肝脏免疫组化切片结果显示：与空白对照组相比,INH/RFP处理组枯否细胞活化水平明显降低,甚至消失,DATS对照组未见统计学差异；DATS低剂量联合处理、中剂量联合处理、高剂量联合处理组枯否细胞活化水平明显恢复。6、肝脏组织内IL-1β, TNF-α水平变化情况与空白对照组相比,IL-1β的水平INH/RFP处理组水平明显降低39%(P<0.01), DATS对照组未见统计学差异；与INH/RFP处理组比较,DATS低剂量联合处理、中剂量联合处理、高联合处理组的IL-1β分别增加了52%(P<0.05),82%(P<0.01),113%(P<0.01)。与空白对照组相比,TNF-α的水平INH/RFP处理组水平明显升高了20%(P<0.01), DATS对照组未见统计学差异；与INH/RFP处理组比较,DATS低剂量联合处理、中剂量联合处理、高联合处理组的IL-1β分别增加了6%,13%(P<0.05),16%(P<0.05)。结论1、三硫二丙烯对异烟肼和利福平联合所致小鼠肝损伤具有保护作用2、三硫二丙烯对异烟肼和利福平联合所致小鼠肝损伤的保护机制可能与其抗氧化机制有关。3、三硫二丙烯对异烟肼和利福平联合所致小鼠肝损伤的保护机制可能与其激活肝脏组织内的枯否细胞的正常免疫功能,抑制了炎症反应有关。