卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种促性腺糖蛋白激素,主要功能为促进颗粒细胞增生,刺激类固醇生成,调节配子细胞的发育和成熟,是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。研究发现FSH还在生殖系统肿瘤、骨质疏松和肿瘤血管形成过程中发挥重要作用,提示FSH有可能作为以上疾病治疗和诊断的新靶标。纳米抗体是源自骆驼科动物重链可变区的分子最小的单域抗体。目前主要通过噬菌体展示技术获得。但是传统的噬菌体展示文库存在多样性不足、筛选所得的克隆代表性不够以及筛选过程费时费力等缺点。高通量技术能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,覆盖了几乎全部B细胞库容(107),解决了传统噬菌体文库筛选的限制。通过高通量测序技术对筛选前后的噬菌体进行测序,通过前后抗体序列的富集情况,可以获得抗体基因序列。本研究采用FSHβ33-53肽段进行文库的筛选,通过高通量测序技术以及辅助噬菌体文库展示技术,筛选出特异性的纳米抗体。本研究主要进行三方面研究:1.VHH噬菌体展示天然文库的构建以及亲和筛选采集未免疫的骆驼血液,分离总淋巴细胞,提取总的RNA,反转录获得cDNA。PCR获得VHH基因构建到pMECS载体上,电转化到TG1细胞中构建天然噬菌体骆驼文库。库容大小在1.6×109(CFU)/mL。通过噬菌体展示技术进行四轮筛选,用单克隆phage ELISA进行鉴定,挑选阳性的单克隆测序。获得抗体序列VHH-FA7、VHH-FC7、VHH-FB8并亚克隆到原核表达载体pET22b,转化到BL21(DE3)细胞中进行诱导、表达和纯化。ELISA实验中测纳米抗体与FSHβ33-53的结合活性和亲和力。结果表明,单克隆噬菌体ELISA阳性的三个克隆VHH-FA7、VHH-FC7、VHH-FB8纯化蛋白与FSHβ33-53结合力都不高。2.高通量测序鉴定和筛选展示文库亲和筛选前后的噬菌体序列将第一轮输入沉降的噬菌体和第四轮输出的噬菌体进行高通量测序。得到五个富集的抗体序列VHH-1296,VHH-6254,VHH-27036,VHH-40740,VHH-32180,分别将5个抗体基因构建到pET22b载体并转化到BL21(DE3)细胞中,IPTG诱导表达。FSHβ33-53浓度为10μg/mL作为一抗,二抗为链霉素-HPR(1:2500)。TMB显色,450nm下测定OD值。根据OD值确定抗体VHH蛋白与抗体的结合能力。结果:VHH6254在5μg/mL时的结合力为0.4左右,而VHH40740,VHH1296,VHH32180,VHH40740在浓度为5μg/mL时与与FSHβ的结合力较低。3.采用亲和力转移方法将FSHR结合肽移植到骆驼纳米抗体抗原结合区快速获得抗FSHR抗体将FSHR结合肽FSH33-53编码序列分别移植入纳米抗体cAbBCII10的CDR1和CDR3区域中命名为VHH-hFSH1和VHH-hFSH3。并克隆到pET22b载体上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导蛋白。采用ELISA方法鉴定纯化的cAbBCII10,VHH-hFSH1、VHH-hFSH3与FSHR的结合力及特异性。结果:通过框架移植获得的VHH-hFSH1,VHH-hFSH3和cAbBCII10蛋白均在细菌胞间质可溶性表达。ELISA实验表明将FSH33-53移植到cAbBCII10的CDR3获得的VHH-hFSH3具有特异结合FSHR活性。结论:cAbBCII10具有作为非抗体亲和力转移骨架的潜能的,但需要进一步优化移植序列以获得高亲和力的抗体。本研究表明,利用高通量测序技术与生物信息学分析相结合,可获得并制备得到具有一定结合力的抗FSHβ33-53的骆驼纳米抗体,说明利用高通量测序技术有可能发现新的纳米抗体。但欲获得高亲和力的抗体还需要结合免疫前的抗体序列丰度分析,以及对实验条件进行优化和对数据进行深入挖掘。