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多能干细胞是一类具有无限制自我更新能力、同时可以分化成特定组织细胞的细胞,其主要包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC)与诱导性多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell,iPS)两大类,在研究细胞的分化、基因的遗传修饰和再生医学等方面具有重要的研究和应用价值。猪因在解剖、生理及遗传学方面与人类很相似,因此被当作人类疾病模型及异种器官移植的潜在供体。目前虽然也有诸多关于猪的多能干细胞方面的研究,但一直没有建立起真正的猪naive状态的多能干细胞建系。本研究首先利用核转染技术将鼠源OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC四个转录因子表达载体转入猪胎儿成纤维细胞,并通过在培养液中添加 LIF、bFGF、CHIR99021、PD0325901 及 SB431542,成功的建立了猪naive-like诱导性多能干细胞系,并对其进行了红色荧光蛋白标记;本研究同时利用转有鼠源OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC基因的PEF细胞作为核供体,经体细胞核移植获得克隆囊胚,继而将囊胚的内细胞团接种于饲养层细胞之上,在与培养诱导性多能干细胞相同的培养条件下,建立起了猪naive-like胚胎干细胞系。通过以上两个方面的研究,本文着重探索利用iPS技术辅助建立猪naive胚胎干细胞的新方法,为以后通过猪胚胎干细胞研究猪的胚胎发育、基因连续打靶及胚胎嵌合等提供研究基础。目的建立猪naive-like诱导性多能干细胞系,并向所建立的猪iPS细胞系中转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行红色荧光标记;利用iPS技术辅助建立猪naive-like胚胎干细胞系。方法1.建立红色荧光标记的猪iPS细胞系:利用核转染技术,向猪胎儿成纤维细胞(Porcine Embryonic Fibroblast,PEF)中转入鼠源 OCT4、SOX2、KLF4 及 c-MYC四因子表达载体TetO-FUW-OSKM(OSKM)与激活表达载体FUW-M2rtTA(M2rtTA),通过药物筛选并结合PCR鉴定,获得同时转入OSKM与M2rtTA质粒的转基因细胞株;以ICR小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)作为饲养层,将转基因细胞株接入到饲养层细胞之上,在含有DOX的干细胞培养液的诱导下建立猪iPS细胞系;对长出的猪iPS细胞的多能性进行鉴定,包括碱性磷酸酶染色、RT-PCR鉴定多能基因表达、免疫荧光染色及western blot鉴定多能因子表达、体外类胚体分化实验及细胞信号通路鉴定;向所建立的猪iPS细胞中转入红色荧光表达载体pEF1alpha-DsRed-Express2 Vector,对其进行红色荧光标记;通过碱性磷酸酶染色、RT-qPCR及免疫荧光染色鉴定携带有红色荧光标记的猪iPS细胞是否依然具有多能性。2.利用iPS技术辅助建立猪naive-like胚胎干细胞系:以同时转入OSKM与M2rt-TA质粒的转基因细胞作为核供体细胞,通过体细胞核移植的方法获得转基因克隆囊胚,并利用免疫外科法去掉囊胚的滋胚层获得内细胞团,继而将其接种到饲养层细胞上,经含有DOX的干细胞培养液培养,获得naive-like猪胚胎干细胞;通过碱性磷酸酶染色鉴定不同传代次数的胚胎干细胞的多能性;经RT-PCR鉴定干细胞内外源OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC以及其他相关基因的表达;免疫荧光染色结合western blot鉴定干细胞多能因子的表达;体外类胚体分化实验鉴定干细胞的体外分化能力;通过向培养液中添加小分子抑制剂以及western blot鉴定干细胞增殖所依赖的信号通路;降低培养液中DOX的浓度,通过RT-qPCR鉴定干细胞中内外源OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC表达的变化;RT-qPCR鉴定所建立的胚胎干细胞与所建立的iPS细胞之间内外源OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC表达的差异;利用microRNA芯片分析所建立胚胎干细胞、猪体外受精囊胚内细胞团及猪胎儿成纤维细胞之间microRNA表达谱的差异。结果1.成功建立了红色荧光标记的猪iPS细胞系:转基因细胞经含有DOX的干细胞培养液的诱导培养,成功获得了猪naive-like诱导性多能干细胞系。该细胞系克隆外形呈三维立体状,可以通过胰蛋白酶消化进行单细胞传代,具有正常的核型,碱性磷酸酶染色结果呈阳性;经过RT-PCR、免疫荧光染色及western blot结果显示,该细胞系表达 OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG、SSEA-1及TRA-1-81等多种多能因子;提取通过悬滴培养形成的类胚体的RNA,RT-PCR鉴定结果显示有NCSTN、OSTEONECTIN及NEUROD等三胚层相关的基因的表达;P-STAT3蛋白western blot结果表明该细胞系通过LIF/STAT3信号通路维持自我更新;向所建立的细胞系中转入红色荧光蛋白表达载体,成功对其进行红色荧光标记,对标记后的细胞进行碱性磷酸酶染色及免疫荧光染色鉴定,结果显示被红荧光标记后的干细胞依然具有多能性。2.利用iPS技术辅助成功建立猪naive-like胚胎干细胞系:转基因囊胚的内细胞团经含有DOX的干细胞培养液培养,成功获得了猪naive-like胚胎干细胞系。该细胞系具有正常的核型,细胞克隆外形呈三维立体状,可通过胰蛋白酶消化进行单细胞传代,类似于小鼠胚胎干细胞;该细胞系碱性磷酸酶染色结果呈阳性,经RT-PCR、免疫荧光染色及western blot鉴定结果显示其表达OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG、SSEA-1、SSEA-4、LIN28、TBX3 及 DPPA5 等多种多能因子;经体外类胚体分化,可形成三胚层相关的细胞;信号通路鉴定结果显示,所建立的细胞系通过LIF/STAT3信号通路维持其多能性;降低培养液中的DOX含量,发现细胞中外源mOCT4、mSOX2、mKLF4及mc-MYC表达下降,而内源pSOX2及pc-MYC表达升高;与所建立的诱导性多能干细胞相比,该细胞系外源mOCT4、mSOX2、mKLF4及mc-MYC表达比较低,而内源pSOX2、pKLF4及pc-MYC比较高;microRNA芯片分析结果显示,所建立的胚胎干细胞的microRNA表达谱与猪体外受精囊胚内细胞团更为接近。结论1.成功建立起了红色荧光标记的猪naive-like诱导性多能干细胞系,为以后通过红荧光示踪猪naive iPS来研究细胞发育和分化奠定基础。2.成功利用iPS技术辅助建立起了猪naive-like胚胎干细胞系,为以后猪naive胚胎干细胞建系的研究提供借鉴。