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miRNA主要通过与靶mRNA的3’端结合降解或抑制靶基因的翻译，从而对靶基因进行转录后调控。由于miRNA识别靶基因并不是一一对应的关系，存在着几个不同的miRNA联合调控同一个靶基因的可能，而一个miRNA也可能调控多个靶基因。我们之前研究发现，斑马鱼中cyb561d2是miR-155的靶基因，并且在氟虫腈（5-氨基-1-[2,6-二氯4-（三氟甲基）苯基]-4-[（三氟甲基）亚磺酰基]-1H-吡唑-3-腈）的胁迫下cyb561d2的表达受miR-155的调控。在本实验中，我们通过Microcosm Targets预测发现cyb561d2有可能是miR-194a、miR-216b、miR-429和miR-499共同的靶基因，通过实验验证了这4个miRNAs分别与cyb561d2之间的关系。我们评估了氟虫腈暴露下斑马鱼中这4个miRNAs的表达，研究4种miRNAs能否调控cyb561d2的表达，结果发现随着氟虫腈处理浓度的升高，斑马鱼中miR-216b和miR-499的表达量明显下调，而miR-194a与miR-429的表达量却没有明显变化。 为了解释氟虫腈处理后miRNA表达的变化，同时验证生物信息学预测的结果。我们通过重叠延伸PCR将cyb561d23’-UTR中miR-194a、miR-216b、miR-429和miR-499推定结合位点分别敲除，成功构建了4个重组海肾荧光素酶载体，分别命名为pRL/S-K.O-194a、pRL/S-K.O-216b、pRL/S-K.O-429、pRL/S-K.O-499。通过双荧光素酶报告基因法验证了斑马鱼cyb561d23’-UTR中存在miR-216b和miR-499的结合位点，而并不存在miR-194a和miR-429的直接结合位点。 我们通过对ZF4细胞转染miR-499 mimic后，检测细胞中cyb561d2的表达量，发现cyb561d2在mRNA水平及蛋白水平都显著下调，而转染miR-499 inhibitor后，cyb561d2的mRNA水平及蛋白水平则显著上调，同样的对ZF4细胞转染miR-216b mimic后，cyb561d2的表达量下调，转染miR-216b inhibitor后， cyb561d2的表达量则显著上调，然而对ZF4转染miR-194a或miR-429 mimic，细胞中cyb561d2 mRNA的表达并没有发生明显的变化。综上所述，我们发现cyb561d2是miR-216b和miR-499的靶基因，而不是miR-194a和miR-429的靶基因，而在氟虫腈暴露下miR-216b与miR-499的变化表明其可以作为暴露于氟虫腈环境的生物标志物。