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【目的】
心肌纤维化(Myocardialfibrosis,MF)是多种心血管疾病的共同病理改变,也是心血管疾病在发展过程中心肌发生重构,心功能逐渐下降的主要原因。本课题采用异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)制备大鼠MF模型,给予中药复方参附芎泽方干预,探索不同剂量参附芎泽方对大鼠心肌纤维化的治疗作用;进一步观察不同剂量参附芎泽方对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响,为中医药防治MF寻找新的治疗靶标。
【方法】
1模型建立、实验分组及样本采集
将60只SPF级雄性SD大鼠(180—200g)随机分为空白组(10只)、造模组(50只),造模组大鼠采用ISO皮下多点注射,剂量为20mg/kg·d、10mg/kg·d、5mg/kg·d逐渐递减3天,后面以3mg/kg·d剂量连续注射7天,大鼠心肌组织Masson染色胶原纤维异常增多为MF模型制备成功。空白对照组10只,按照随机分组法将MF模型大鼠分为模型组,参附芎泽方低剂量组(含生药1.6g/ml),参附芎泽方中剂量组(含生药3.2g/ml),参附芎泽方高剂量组(含生药6.4g/ml),每组9只。各组按照5ml/kg的剂量灌胃,一天一次,给药4周后,大鼠称重,10%水合氯醛(按照0.0030-0.0035ml/g剂量)腹腔注射麻醉,腹主动脉取血后,迅速取出心脏并去除血管、脂肪等非心肌组织,分离左心室,一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,另一部分置于-80℃冰箱保存待用。
2各组大鼠血清指标检测、病理形态学观察及WesternBlotting检测
ELISA法检测各组大鼠血清PGI2及TXB2含量变化,HE染色法观察大鼠心肌细胞形态学改变,Masson染色观察大鼠心肌组织胶原纤维增生情况,免疫组化和WesternBlotting检测各组大鼠心肌组织的Fzd,β-catenin蛋白表达变化。
【结果】
1各组大鼠一般情况及血清指标的变化
空白组大鼠毛发光泽顺畅,四肢末梢循环正常,饮食饮水正常,精神状态良好;模型组大鼠毛发欠光泽稍发黄,四肢末梢轻微发紫,造模期间饮食饮水差,造模结束后基本恢复正常,精神状态稍差,活动较少;参附芎泽方各剂量组大鼠毛发稍欠光泽,颜色稍发黄,饮食饮水基本正常,精神状态一般,四肢末梢循环基本恢复正常,活动量少于正常组。
与空白组相比,模型组大鼠血清PGI2显著降低,TXB2显著增高,说明ISO可以导致大鼠血清血小板聚集增加,参附芎泽方中剂量组、高剂量组血清PGI2及TXB2与模型组相比有显著差异,且参附芎泽方高剂量组差异最显著。
2各组大鼠心肌组织病理学的变化
心肌组织HE染色显示空白组大鼠的心肌细胞排列比较整齐,细胞核大小基本一致,心肌纤维横纹清晰,未发现肿胀、萎缩;与空白组相比,模型组大鼠心肌细胞排列比较紊乱,细胞核大小不一致,心肌纤维大部分可见断裂、溶解;与模型组相比,参附芎泽方各剂量组大鼠心肌细胞排列较整齐,心肌细胞大小基本一致。Masson染色显示空白组大鼠心肌纤维排列整齐,细胞间质略有少量蓝色胶原纤维;与空白组相比,模型组大鼠心肌纤维化程度显著增加,大量胶原纤维呈蓝色分布在心肌间质中;与模型组相比,参附芎泽方各剂量组大鼠心肌纤维化程度显著减少,且参附芎泽方高剂量组大鼠胶原纤维减少最明显。上述结果表明参附芎泽方能够改善ISO所致MF大鼠心肌细胞排列紊乱,心肌纤维断裂的现象,减少心肌间质胶原纤维的表达,抑制胶原合成。
3各组大鼠心肌组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的变化
免疫组化与WesternBlotting检测结果表明,与空白组相比,模型组大鼠心肌组织的Fzd蛋白、β-catenin蛋白的表达显著增加;与模型组相比,参附芎泽方各剂量组Fzd、β-catenin蛋白的表达逐渐下降,且参附芎泽方高剂量组Fzd、β-catenin蛋白的表达下降最显著。综上所述,参附芎泽方能够降低ISO所致MF大鼠心肌组织Wnt/β-catenin信号通路中Fzd、β-catenin蛋白表达。
【结论】
1参附芎泽方可抑制ISO所致大鼠心肌纤维化的进展,且参附芎泽方高剂量效果优于低剂量与中剂量。
2参附芎泽方可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达,减轻ISO所致大鼠心肌纤维化的作用。
心肌纤维化(Myocardialfibrosis,MF)是多种心血管疾病的共同病理改变,也是心血管疾病在发展过程中心肌发生重构,心功能逐渐下降的主要原因。本课题采用异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)制备大鼠MF模型,给予中药复方参附芎泽方干预,探索不同剂量参附芎泽方对大鼠心肌纤维化的治疗作用;进一步观察不同剂量参附芎泽方对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响,为中医药防治MF寻找新的治疗靶标。
【方法】
1模型建立、实验分组及样本采集
将60只SPF级雄性SD大鼠(180—200g)随机分为空白组(10只)、造模组(50只),造模组大鼠采用ISO皮下多点注射,剂量为20mg/kg·d、10mg/kg·d、5mg/kg·d逐渐递减3天,后面以3mg/kg·d剂量连续注射7天,大鼠心肌组织Masson染色胶原纤维异常增多为MF模型制备成功。空白对照组10只,按照随机分组法将MF模型大鼠分为模型组,参附芎泽方低剂量组(含生药1.6g/ml),参附芎泽方中剂量组(含生药3.2g/ml),参附芎泽方高剂量组(含生药6.4g/ml),每组9只。各组按照5ml/kg的剂量灌胃,一天一次,给药4周后,大鼠称重,10%水合氯醛(按照0.0030-0.0035ml/g剂量)腹腔注射麻醉,腹主动脉取血后,迅速取出心脏并去除血管、脂肪等非心肌组织,分离左心室,一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,另一部分置于-80℃冰箱保存待用。
2各组大鼠血清指标检测、病理形态学观察及WesternBlotting检测
ELISA法检测各组大鼠血清PGI2及TXB2含量变化,HE染色法观察大鼠心肌细胞形态学改变,Masson染色观察大鼠心肌组织胶原纤维增生情况,免疫组化和WesternBlotting检测各组大鼠心肌组织的Fzd,β-catenin蛋白表达变化。
【结果】
1各组大鼠一般情况及血清指标的变化
空白组大鼠毛发光泽顺畅,四肢末梢循环正常,饮食饮水正常,精神状态良好;模型组大鼠毛发欠光泽稍发黄,四肢末梢轻微发紫,造模期间饮食饮水差,造模结束后基本恢复正常,精神状态稍差,活动较少;参附芎泽方各剂量组大鼠毛发稍欠光泽,颜色稍发黄,饮食饮水基本正常,精神状态一般,四肢末梢循环基本恢复正常,活动量少于正常组。
与空白组相比,模型组大鼠血清PGI2显著降低,TXB2显著增高,说明ISO可以导致大鼠血清血小板聚集增加,参附芎泽方中剂量组、高剂量组血清PGI2及TXB2与模型组相比有显著差异,且参附芎泽方高剂量组差异最显著。
2各组大鼠心肌组织病理学的变化
心肌组织HE染色显示空白组大鼠的心肌细胞排列比较整齐,细胞核大小基本一致,心肌纤维横纹清晰,未发现肿胀、萎缩;与空白组相比,模型组大鼠心肌细胞排列比较紊乱,细胞核大小不一致,心肌纤维大部分可见断裂、溶解;与模型组相比,参附芎泽方各剂量组大鼠心肌细胞排列较整齐,心肌细胞大小基本一致。Masson染色显示空白组大鼠心肌纤维排列整齐,细胞间质略有少量蓝色胶原纤维;与空白组相比,模型组大鼠心肌纤维化程度显著增加,大量胶原纤维呈蓝色分布在心肌间质中;与模型组相比,参附芎泽方各剂量组大鼠心肌纤维化程度显著减少,且参附芎泽方高剂量组大鼠胶原纤维减少最明显。上述结果表明参附芎泽方能够改善ISO所致MF大鼠心肌细胞排列紊乱,心肌纤维断裂的现象,减少心肌间质胶原纤维的表达,抑制胶原合成。
3各组大鼠心肌组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的变化
免疫组化与WesternBlotting检测结果表明,与空白组相比,模型组大鼠心肌组织的Fzd蛋白、β-catenin蛋白的表达显著增加;与模型组相比,参附芎泽方各剂量组Fzd、β-catenin蛋白的表达逐渐下降,且参附芎泽方高剂量组Fzd、β-catenin蛋白的表达下降最显著。综上所述,参附芎泽方能够降低ISO所致MF大鼠心肌组织Wnt/β-catenin信号通路中Fzd、β-catenin蛋白表达。
【结论】
1参附芎泽方可抑制ISO所致大鼠心肌纤维化的进展,且参附芎泽方高剂量效果优于低剂量与中剂量。
2参附芎泽方可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达,减轻ISO所致大鼠心肌纤维化的作用。