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目的观察毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA、大黄素对LPS诱导损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的干预作用,探讨三种中药单体通过调控Rho/ROCK通路、AKT通路对内皮细胞细胞骨架及通透性的影响,为其对内皮细胞功能的保护作用提供实验支持,同时为中医采用补气活血清热泄浊法治疗内皮损伤相关性疾病提供理论依据。方法首先以0.2μg/ml LPS作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)24h,造成血管内皮损伤模型。Y27632(ROCK特异性抑制剂)和缬沙坦(西药对照,AngⅡ受体1拮抗剂,Rho/ROCK信号通路的间接抑制剂)作为阳性对照药物。我们分别依次观察了毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA、大黄素对LPS诱导的内皮损伤后的HUVECs的变化：MTT法观察细胞存活率、流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色观察凋亡率,transwell观察细胞迁移能力,10mg/mL波连蛋白预包被/无包被96孔板观察细胞黏附能力,硝酸还原酶法观察细胞培养上清中的cNOS、iNOS和NO浓度,免疫荧光观察细胞骨架和黏着斑蛋白的结构和分布。研究中,三种中药单体都表现出卓越的内皮细胞保护能力。然后我们试图对三种中药单体的内皮细胞保护机制进行探讨。首先,以内皮细胞生物学功能PCR基因芯片技术筛选可能的基因谱,发现细胞骨架重构相关基因,如IRho/ROCK、AKT和FAK-PI3K信号通路相关基因在其中起重要作用,尤以Rho/ROCK通路为主。结合基因芯片结果和文献中各基因功能,拟定观察Rho/ROCK通路中的关键基因如纤连蛋白(fibronectin、FN),整合素A5(integrin A5, ITGA5), Ras同源基因家族成员(Ras homolog gene family member A, RhoA),肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinase, PI3K),黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2)的mRNA表达水平,进行实时定量PCR验证,同时以Western blotting对ITGA5, RhoA,4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol4,5-bisphosphate, PIP2)和磷酸化的肌球蛋白轻链(Phosphorylated myosin light chain, PMLC)进行蛋白水平的研究。结果(1)LPS成功诱导构建了HUVECs细胞骨架损伤模型。HUVECs细胞增殖减弱、凋亡增加,细胞骨架肌动蛋白皱缩、黏着斑蛋白聚集,LPS活化内皮、诱导肌球蛋白收缩,导致细胞间隙开放、内皮通透性增加、细胞迁移能力和黏附能力下降。LPS作用24h后,cNOS减低,tNOS、iNOS、NO升高,呈现内皮损伤和炎症状态。同时,LPS激活Rho/ROCK信号通路,提高Rho/ROCK通路相关基因、蛋白的表达(FN, ITG A5, RhoA, MLCP, PI3K FAK, VEGF, VEGFR2)。Y27632和缬沙坦特异性阻断了Rho/ROCK通路,显现出对细胞骨架损伤的较强的保护作用。(2)毛蕊异黄酮诱导HUVECs细胞凋亡、提高细胞迁移能力、降低黏附能力、cNOS升高、iNOS减低、细胞骨架和黏着斑蛋白形态和分布状况改善,即减少细胞数量、提高细胞质量。毛蕊异黄酮的内皮保护作用涉及多条信号通路。毛蕊异黄酮通过增加NO的生成促进MLCP的激活,MLCP活化后降低PMLC,直接对抗Rho/ROCK通路的活化,同时通过降低、VEGF、 VEGF.R2和PI3K阻断AKT信号通路,发挥其内皮保护作用。(3)丹参酮ⅡA抑制HUVECs细胞凋亡、改善了细胞骨架肌动蛋白和黏着斑蛋白的形态和分布状况、提高细胞迁移和黏附能力,提高cNOS浓度。丹参酮ⅡA是内皮细胞强保护剂,其机制主要是通过下调ITG A5的表达而阻断Rho/ROCK通路的激活。(4)大黄素诱导HUVECs细胞凋亡、提高细胞迁移能力和黏附能力、cNOS升高、iNOS减低,但对细胞骨架和黏着斑蛋白基本没有改善作用。大黄素的内皮保护作用复杂,涉及多条信号通路,通过轻度抑制Rho/ROCK通路、调节AKT和/或FAK-PI3K信号通路发挥调节保护作用。结论(1)LPS诱导了HUVECs细胞骨架损伤,毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA、大黄素通过稳定细胞骨架结构、调节凋亡率、调节细胞合成和利用NO的能力、改变细胞迁移和黏附能力,而调节血管内皮通透性、改善内皮屏障功能。(2)丹参酮ⅡA抑制HUVECs凋亡,毛蕊异黄酮和大黄素促进HUVECs凋亡,维持调节内皮细胞数量的稳定。(3)三种中药单体对细胞骨架的保护机制分别涉及多个信号通路和信号通路间的串话,以Rho/ROCK信号通路为最主要的调节通路,还涉及AKT和/或FAK-PI3K通路,及其彼此间的串话。毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA、大黄素均参与了Rho/ROCK通路的调节,其中,毛蕊异黄酮同时还通过降低VEGF、VEGF.R2和PI3K阻断AKT信号通路,发挥作用；丹参酮ⅡA以下调ITGA5的表达而阻断Rho/ROCK通路的激活为主,同时也经PI3K和NO与其他通路互相协调：大黄素的调节机制较为复杂,通过轻度抑制Rho/ROCK通路、调节AKT和/或FAK-PI3K信号通路发挥调节保护内皮细胞的作用。(4)虽然机制和过程不同,但三个中药单体均显示了对细胞骨架损伤后修复的调节功效和对内皮细胞的保护作用。研究意义本研究首次将中药单体的内皮保护机制与基因芯片技术联系起来,从对细胞骨架损伤后修复、内皮细胞通透性的调节和机制的角度进行了研究。从细胞和分子水平观察了炎症损伤时,血管内皮细胞的变化；选用补气、活血、清热解毒类中药单体对炎症损伤进行干预治疗时血管内皮细胞的改善状况,并从分子水平初步探讨其药效机制(以Rho/ROCK信号通路为主、涉及可能的AKT和FAK-PI3K信号通路关键的基因和蛋白的表达)。从客观的角度为补气活血清热解毒类药物治疗内皮损伤相关疾病提供了有力的实验依据和理论基础。