嗅鞘细胞具有中枢神经系统星形胶质细胞和周围神经系统施万细胞的特性,能与中枢神经系统充分融合,促进中枢神经元轴突的再生。近年来在脊髓损伤研究中还发现嗅鞘细胞具有成髓鞘、减轻星形胶质细胞反应及神经保护作用。嗅鞘细胞具有如此之多的优点,已使其成为可供中枢神经系统损伤后移植治疗的重要备选细胞。但目前动物研究中仍存在两个问题亟待解决:其一,纯化与非纯化的嗅鞘细胞悬液均被用于移植修复中枢神经系统损伤,但对纯化还是非纯化的嗅鞘细胞具有更佳疗效仍存在争议,至今尚无学者在体外培养或体内移植的条件下对不同纯度嗅鞘细胞的存活状态及其作用进行过比较研究。其二,嗅鞘细胞条件培养液对体外培养的正常视网膜神经节细胞不具保护作用,但对损伤的视网膜节细胞是否具有保护作用仍属未知。根据以上问题,我们开展了两部分实验。第一部分:比较不同纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用最佳纯度提供实验依据。分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%、65%、50%及35%的比例混合后接种,继续培养1d或3d。所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学荧光染色,以鉴定嗅鞘细胞的初始混合比例及其后培养过程中纯度的变化。相差显微镜下观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞,求得各组嗅鞘细胞纯度并统计学分析。结果显示,在接种培养至1d时,所有纯度的嗅鞘细胞均显示正常形态,胞体饱满发亮,呈三角形或梭形,细胞发出纤细的突起,蹼状生长锥样结构明显。培养第3d时,纯度为80%的嗅鞘细胞已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(p=0.02)。但纯度未发生明显变化。而纯度为65%、50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降。纯度为35%的嗅鞘细胞在这1d和3d两时间点外观仍属正常。但是细胞数量和纯度均显著性降低(p<0.05)。P75免疫阳性细胞均数分别为16±4和7±4;细胞纯度分别为37%±3%和20%±8%。结论:65%,50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于其它纯度者,提示体内移植时应考虑选取纯度在50%到65%之间的嗅鞘细胞。第二部分:观察嗅鞘细胞条件培养液是否对机械性损伤的视网膜神经节细胞具有保护作用。嗅鞘细胞条件培养液(olfactory ensheathing cells conditioned medium, OECCM)为成年SD大鼠嗅鞘细胞的培养上清液。将体外培养的正常视网膜神经节细胞划伤后,分为实验1和实验2:实验1分OECCM和正常培养基对照两组(每组n=8),培养3d和6d时在相差显微镜下观察细胞生长状态,再行β-Ⅲtubulin免疫荧光染色以鉴定视网膜神经节细胞并计数阳性细胞数量;实验2分划伤细胞+OECCM、划伤细胞+正常培养基对照、正常细胞+OECCM和正常细胞+正常培养基对照四组(每组n=8),培养3d和6d时以MTT方法观察细胞的活性变化。结果:实验1划伤细胞经OECCM处理后存活状态较好,胞体完整并且遮光性较好,突起向划痕周边延伸生长。而在对照组,靠近划痕的大部分受损细胞胞体肿胀崩解,突起退缩、断裂或崩解;OECCM组划痕区内3d和6d时β-Ⅲtubulin阳性细胞数(29.67±3.50和19.8±2.8)均显著高于对照组(6.81±2.20和13±0.6,p<0.05);在远离划痕2 mm的区域,两组细胞在这两个时间点的生长状态与β-Ⅲtubulin阳性细胞数量均无明显差异。实验2 MTT结果显示,划伤细胞加入OECCM 3d和6d时OD值(1.2736±0.0562和1.1628±0.1599)均显著高于对照组(1.1046±0.1268和1.1132±0.1128,p<0.01),而OECCM对未损伤的细胞活性无显著影响。结论:在体外培养条件下,OECCM对机械性损伤的视网膜神经节细胞具有明确的保护作用,但对未经损伤的正常视网膜神经节细胞无明显影响。