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一 NTRK1突变与特殊表型“无痛无汗”目的观察无痛无汗症表型,筛查NGF、NTRK1的突变并加以分析,以便对NGF、NTRK1的突变频率、好发位点及种族特点有更深入的了解,为下一步研究NGF.NTRK1的核苷酸多态性位点与痛觉敏感性相关性分析打下基础。方法搜集中国汉族的无痛无汗症患儿,抽取患儿及其父母的外周血,提取DNA,PCR扩增NGF的三个外显子和NTRK1的17个外显子,包括内外显子连接处50个碱基。用Sanger法对扩增片段进行双向测序,测序结果用比对软件chromas2.22读取峰图文件,与参考序列NG 007493.1和NM 002529.3进行比对,鉴定出目标片段中的杂合或纯合突变。按照人类基因组变异学会(Human Genome Variation Society,HGVS)发布的人类基因组变异命名指南对发现的突变进行命名,通过在线工具Variation Reporter提交至NCBI网站,在dbSNP、dbVar、ClinVar等数据库中检索突变的注释信息。根据基因和蛋白质的结构与功能注释对移码突变和无义突变产生的后果进行分析。通过评估氨基酸替换分数、氨基酸进化保守性、氨基酸在蛋白质结构中的位置,对错义突变的功能进行分析,并利用生物信息学软件进一步验证分析结果。同时,对鉴定出的致病突变在1006个健康志愿者中采用连接酶检测反应法进行筛查,以确定突变在中国一般人群中的发生率。结果共搜集到13例无痛无汗症患者,来自11个独立家庭。在这13例患者中,未检测到NGF致病突变,在NTRKl中共鉴定出10个可疑致病突变,包括1个移码突变,1个无义突变,6个错义突变和2个内含子突变。在这10个突变中,有3个是新发现突变,有3个是在无痛无汗症患者中首次发现。健康人群筛查结果显示这10个突变在一般人群中的发生率极低,功能分析显示这10个突变都是影响蛋白质功能的致病突变,并且集中位于酪氨酸激酶区域和结合NGF区域。另外还发现突变c.1804C>T和c.963delG可能是中国汉族患者中的常见致病突变。结论在本研究中,我们在无痛无汗症患者中筛查到10个NTRK1致病突变,其中有3个突变是首次发现,3个突变是在无痛无汗症患者中首次发现。NTRK1发生突变的频率远高于NGF,提示我们在研究NGFINTRK1核苷酸多态性对其功能的影响时,NTRK1可能有更多的SNPs有临床意义。同时,NTRK1的突变多位于胞外NGF结合区域和胞内酪氨酸激酶信号转导区域,这为我们下一步在研究疼痛敏感性时,对NTRK1核苷酸多态性的选择和分析具有重要的指导意义。NTRK1突变的种族特点还需要进一步研究,其结果有助于判断基因型与具体表型之间是否存在一定的联系,从而更加深入的理解基因结构与功能之间的关系。二 NTRK1单核苷酸多态性与疼痛个体差异关联性分析目的对NTRK1的SNPs与疼痛敏感性进行关联性分析,评价NTRK1 SNPs在疼痛个体差异中的作用。方法在华中科技大学同济医学院选择在校健康女大学生作为研究对象,对她们进行机械痛阈值和热痛阈值测量,并抽取外周血,提取DNA。用Haploview 4.2软件,以人类基因组单体型图(HapMap)第3期数据库中的汉族人群(CHB)数据为基础,将成对r2极点设置成0.8,筛选出HapMap数据库中次等位基因频率≥5%的标签SNPs。采用连接酶检测反应法对提取的DNA样本进行标签SNPs分型。所获得的数据采用PLINK 1.07 (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)进行基因关联分析。对样本人群检测的每个SNP均采用哈迪-温伯格平衡定律(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)分别检验其是否符合遗传平衡状态,其中HWE检验采用卡方检验方法。采用线性回归分析法分析NTRK1 SNPs与实验性痛觉阈值之间的相关性,以相加模型(即假设每个弱等位基因都有效应)作为分析方法,以实验性痛觉阈值作为因变量,NTRK1 SNPs作为变量,年龄、体重指数等因素作为混杂因素也考虑进线性回归模型之中。采用SPSS17.0统计软件包(SPSS统计学公司,美国)进行人口学资料分析、独立样本t检验和连续型变量的分析,其中符合正态分布的计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,计数资料采用数量和百分比[n(%)]表示。对每一个表型的数据分析都尽可能纳入最大的样本数。以双侧检验p<0.05作为有统计学意义的标准。基因关联分析结果以p<0.01作为有统计学意义,0.01<p<0.05视为有趋势的统计学失联。结果对309名在校女大学生进行了疼痛敏感性测试,并对其进行了13个NTRK1标签SNPs的分型检测和关联分析。结果显示①rs2644604、rs6334、rs1800880与锐压耐痛阈值(S-PTO)有正相关性,Beta值分别为0.25、0.24和0.21,p值均小于0.01②rs4661229与刺痛觉阈值(QPT)呈负相关性,Beta值为-0.47,p值小于0.01③rs10908521与热痛阈值(WLT)呈负相关,Beta值为-0.98,p值小于0.01④另外,rs11264577与钝压痛觉阈值,rs10908521与锐压耐痛阈值,rs56252149、rs10908521与刺痛觉阈值,rs7516736、rs6689750与热痛觉阈值,它们之间有关联趋势但没达到统计学意义标准(0.01<p<0.05)。结论NTRK1 SNPs与女性疼痛敏感性有显著相关性,或是导致疼痛个体差异的遗传基础之一。NTRK1 SNPs对不同性质的疼痛的影响也不同,深入研究有助于我们了解NTRK1对疼痛信号传递通路的影响。在疼痛个体化治疗和未来制作疼痛基因芯片中,NTRK1是不可忽视的一个基因。