云南直缘乌头(Aconitum Transsectum Diels)又名大草乌、小黑牛,产于中国云南西北部。本实验以云南野生型和栽培型直缘乌头作为材料,使用传统的中药炮制方法(蒸煮)进行逐步脱毒,通过HPLC-UV和HPLC-MS对其活性成分含量和结构进行分析,旨在对经过脱毒后的直缘乌头毒性进行评估,并研究快速检测毒性的方法。1直缘乌头基本成分分析采用容量法和比色法测定了不同材料(野生生长与人工栽培的直缘乌头)、不同蒸煮时间(常压下蒸煮1h、3h、6h、9h、12h;加压下蒸煮1h、2h、4h)、不同的蒸煮方式(加压和常压)间直缘乌头总生物碱、游离氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白质的含量。结果表明,可溶性糖占直缘乌头干重的25%-52%;可溶性蛋白质占直缘乌头干重的0.45%-0.89%;游离氨基酸占直缘乌头干重的0.45%-0.96%;总生物碱在野生型生药样中含量为0.023mol/g,在栽培型生药样品中含量为0.020mol/g。从测得的结果看来,可溶性糖是直缘乌头中的主要成分,野生型直缘乌头总生物碱含量要高于栽培型,蒸煮时间和方式对总生物碱量没有很大改变。2直缘乌头毒性成分分析采用有机溶剂提取法提取毒性成分,通过HPLC-UV和HPLC-MS进行检测,对不同处理的直缘乌头中毒性成分进行定性和定量分析。结果表明,不经蒸煮的直缘乌头主要存在保留时间为10.9、17.8、26.1、37.0、56.8、71.9min的生物碱,其分子量分别为421、463、433、601、541、659。经蒸煮处理的样品则主要存在保留时间为10.9、15.4、17.8、23.1、26.1、56.8和70.7min的生物碱,其分子量分别为421、391、463、617、433、541、659。根据分子量推测,其中保留时间为10.9min、23.1min、70.7min的物质可能为塔拉萨敏、8-去乙酰滇乌碱和滇乌碱,其中具有代表性的滇乌碱为毒性较大的双酯型二萜生物碱,在不经蒸煮的直缘乌头中含量较高。结果还表明,无论是生药样还是蒸煮样,野生型和栽培型直缘乌头其生物碱组成成分没有差异,但分子量大的生物碱在不经蒸煮的直缘乌头中含量较高。常压蒸煮时间达6h以上的样品,基本不含有分子量大的生物碱。在蒸煮过程前期,生物碱组成成分与含量变化十分明显,到了蒸煮后期,含量变化趋缓。由此说明常压蒸煮超过6h,加压蒸煮达到4h可达到脱毒的目的,而且加压短时蒸煮与常压长时蒸煮的具有同样的脱毒效果。3毒性检测方法的研究(1)试剂筛?在生草乌的W浸提液中,分别加入A、B、C、D、E试剂,观察显色情况,发现用高浓度的W试剂浸提,再向浸提液中加入D试剂能达到很好的检测效果,由此确定检测试剂为D和高浓度的W试剂。(2)试剂优化通过对呈色物质的全波长扫描,得到其最大吸收波长为522nm;通过在不同时间段对呈色物质进行比色测定,发现该呈色物质具有良好的稳定性;通过正交试验确定了实验室检测最佳条件,即W浓度为90%、D浓度为0.08mL/mL、草乌样品的加入量为0.8g、反应环境温度为20℃。(3)毒性检测使用检测试剂对不同处理的样品进行显色,发现不经蒸煮的生草乌显绯红色,经蒸煮过的草乌,颜色随蒸煮时间的延长绯红色逐渐变淡,最后转变为淡黄色;经比色测定,生草乌的吸光值为0.706,而经常压蒸煮12h的熟草乌,其吸光值为0.115;其比色结果与液相检测结果相对应。可以确定该检测试剂能够简便、快速、有效地检测直缘乌头的毒性。