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目的:通过检测大鼠损伤骨骼肌组织中卫星细胞内经典Wnt通路下游基因MRFs以及Pax7的表达水平,分析是否呈现一定的时间规律,能否应用于损伤时间的推断。方法:1.制备成年大鼠骨骼肌挫伤模型:购买健康成年雄性SD大鼠(体重200±5 g)258只,随机选取6只用作骨骼肌卫星细胞分离提取的纯度检测实验;其余动物进行随机分组:实验组和对照组,实验组再依据不同损伤时间(0 h、4 h、8h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d)分为13个亚组,共14组,每组18只。采用改良的自由落体法制备大鼠骨骼肌挫伤模型,依据设定的时间点腹腔注射2%戊巴比妥钠(30.0 mg/100 g)麻醉过量处死大鼠,之后提取损伤区域的骨骼肌组织;对照组大鼠采用相同的方式处死并取材。2.大鼠挫伤肌组织的形态学观察:将组织块固定于4%多聚甲醛溶液48h后,制作成石蜡切片,进行HE染色,观察骨骼肌损伤区域的病理组织学特点。3.骨骼肌卫星细胞提纯检测实验:采用两步酶消化法(Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶)并结合差速贴壁法从未损伤的大鼠右后肢骨骼肌中提取并纯化出静止期骨骼肌卫星细胞群,并进行Pax7免疫荧光染色,之后进行量化分析,优化实验条件,计算细胞提纯效率。4.依照相同的步骤从实验组及对照组大鼠骨骼肌中提取骨骼肌卫星细胞,所提取的6个细胞样本接种于24孔板中,以进行细胞免疫荧光染色;另6个细胞样本以细胞沉淀的方式储存于-80℃以进行PCR实验。5.细胞免疫荧光染色:对各组所提取的细胞分别进行Pax7、MyoD、Myogenin免疫荧光染色,并使用FL-StrataQuest软件对荧光结果进行量化分析。6.实时荧光定量PCR实验:应用双内参荧光实时定量RT-PCR技术检测各组卫星细胞中Pax7、MyoD、Myf5、MyoG、MRF4 mRNA的相对定量情况。结果:1.HE染色结果显示:大鼠骨骼肌损伤7d内,经历了出血、炎症反应、肌纤维坏死、胞核溶解消失和少量的新生肌纤维的形成,证实骨骼肌挫伤模型制备成功,可进行后续实验。2.通过对提取的卫星细胞进行鉴定,我们发现细胞呈圆形,并具有高度折光性,数据结果分析显示卫星细胞的提取纯度为89.29%。3.空白对照组及不同实验组所提取出的卫星细胞形态上有差异,从损伤后8h以内的骨骼肌中提取出的卫星细胞呈圆形,而损伤后12h的骨骼肌中提取出的细胞开始出现三角形、多边形及梭形,随着损伤时间的延长,骨骼肌中提取出的三角形细胞和梭形细胞的比例逐渐增高。细胞免疫荧光染色结果显示:单个细胞Pax7、MyoD平均荧光强度在损伤后12h开始增加直至伤后7d;而单个细胞myogenin平均荧光强度在损伤后36h组才有明显的增强,时间上稍有延迟;我们发现,从损伤后7d组提取出的细胞中,存在许多具有双核的短梭形细胞,胞核呈椭圆形,具有较强的myogenin荧光信号,状似成肌细胞的初步融合。4.通过PCR反应结果分析,骨骼肌损伤后24 h,Pax7 mRNA水平开始增加,之后维持在较高水平;MyoD和Myf5 mRNA水平均在损伤后48 h开始有一个增高的趋势,其中MyoD mRNA水平变化更加显著,MyoG mRNA也有相似的变化趋势,与MyoD mRNA相比,时间稍有延迟,这与蛋白的变化规律一致。MRF4mRNA水平没有明显的变化规律。结论:依据现有的实验条件,能够成功地提取出纯度较高的骨骼肌卫星细胞(89.29%);骨骼肌卫星细胞在成体骨骼肌损伤后再生修复阶段发挥不可或缺的作用;Pax7、MRFs基因和蛋白表达规律与损伤时间具有相关性,有望应用于推断损伤时间。