研究背景失重即微重力,是物体只表现为质量而不表现为重量的特殊力学环境(10^-6～10^-9g)。在失重飞行引起的一系列人体生理系统变化中,其他生理系统的变化在航天飞行中会达到一种新的平衡状态,返回地面后,经过一段时间可以很快恢复。但骨钙的丢失却持续发展,引起失重性骨质疏松。骨代谢的调节失衡是影响宇航员健康的主要问题。已证实失重性骨质疏松的骨丢失主要是由于骨形成的减少而不是骨吸收的增加。目前航天中采用的各种对抗措施均未能起到理想的效果,因此预防失重性骨丢失的研究已成为国内外航天医学领域的重点和热点课题。我国传统医学,博大精深,已证实对原发骨质疏松症有较好的疗效及较强的优势。补肾疗法是中医治疗骨质疏松症的重要方法,其理论基础源于中医“肾主骨生髓”学说。《医经精义》曰:“肾藏精,精生髓,髓生骨,故骨者肾之所以合也,髓者,肾精所生,精足则髓足,髓在骨内,髓足则骨强。”补肾壮骨中药主要由淫羊藿、生地黄、补骨脂、川续断等组成。我们将中医药理论运用于航天医学研究,在前期的整体实验中我们已经从骨密度、骨生物力学、骨组织形态学、骨生化学各角度对补肾壮骨中药进行了深入研究,证明其对尾吊模拟失重大鼠骨丢失有明显的改善作用。但其在细胞学上改变尚不明确,故本实验选择中药复方仙灵骨葆胶囊制备含药血清。复方仙灵骨葆胶囊是富含植物雌激素的草药制剂,分别含有金雀异黄酮510μg/g、大豆黄素2500μg/g、淫羊藿9200μg/g、补骨脂素930μg/g和异补骨脂素950μg/g,是具有代表性的方剂之一。本实验在研究补肾壮骨中药对失重骨代谢影响整体实验的基础上,观察了该方对体外模拟失重培养的成骨细胞的影响,拟揭示该方对抗骨丢失的细胞学改变。目的本研究主要从细胞学层面上探讨补肾壮骨中药对模拟失重条件下体外培养成骨细胞的影响,拟在细胞水平上揭示该方对抗骨丢失的机制,以期为失重性骨质疏松的临床治疗研究提供新的线索。对象和方法1.成骨细胞的分离、培养、扩增:取新生1d SD大鼠乳鼠,无菌条件下取颅顶骨,去除周围组织;DMEM培养基漂洗后将其剪碎成小于0.5mm³的碎片,经0.25%胰蛋白酶预消化15～20min,间断振荡,弃上清;加入0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶混合液,37℃5%CO₂恒温孵育箱内消化30min,间断振荡,取上清液1,000rpm离心5min,收集细胞接种于含15%胎牛血清的DMEM培养液中,置37℃5%CO₂培养箱内培养,第3d首次换液,第6d首次传代。以后每3d换液一次,5d传代一次。台盼蓝染色记数检测原代细胞悬液活细胞率。依据贴壁培养法分离和扩增成骨细胞,绘制细胞生长曲线,取前6代细胞作为试验对象。2.成骨细胞功能鉴定:采用改良Gomori钙钻法碱性磷酸酶（ALP）染色观察,Von Kossa’s矿化结节染色法检测体外矿化能力。3.复方中药含药血清制备:取健康雄性SD大鼠共28只,随机分为2组。用药组18只,均灌胃给药（复方仙灵骨葆胶囊）一日2次连续5次,于末次给药后1～2小时,乙醚麻醉无菌条件下经腹主动脉采血,冷置1h后离心分离血清,经56℃30min灭活,0.22μm滤膜抽滤除菌,是为含药血清,-20℃冰箱保存备用。正常对照组和模拟失重组,各5只,按相同程序灌等体积水,所取血清是为正常血清,作为对照用。大鼠灌胃给药剂量均按人日用临床剂量,经人—大鼠体表面积比值折算成相当于临床剂量,以4倍量给药。4.建立模拟微重力成骨细胞模型、分组干预:实验分为正常对照组,失重模型组和含药血清不同浓度组,将微载体0.5g和1×10⁷个成骨细胞加入旋转式生物反应器中,添加含10%FBS和5%对照血清（或含药血清,终浓度分别为5%、10%、20%）的DMEM培养基至50ml,排空气泡。调整转速使细胞与微载体的黏附物能随反应器内外筒一起以较为理想的运行轨迹与转筒一起运动后,逐渐加大转速直至30rpm(相当于10^-3G的微重力状态)。置于37℃5%CO₂恒温孵育箱中培养72h。5.ALP、BGP活性测定:对硝基苯酚法测定含药血清作用72h后培养液中ALP活性,放射免疫测定法测定BGP活性。6.成骨细胞凋亡检测:细胞干预培养72h后,胰蛋白酶常规消化,制成细胞悬液,PBS洗涤几次,将细胞重悬于200μL的Binding Buffer,加入10μLAnnexin V-FITC和5μL PI,混匀,避光室温反应15min,加入300μL BindingBuffer,用流式细胞仪检测Annexin-Ⅴ阳性细胞。结果1.成骨细胞生长情况:经“两步消化—组织块培养法”提取的成骨细胞,在相差显微镜下呈三角形、菱形、多边形等不规则形状,透明度好。细胞有触突,胞浆丰富并向外伸展,伸出几个突起与临近细胞伸出的突起相连,有聚集成团（集落）的现象。胞核大而清楚,呈圆形或卵圆形,含1～2个核仁。组织块培养法第3天,倒置显微镜下可见大量成骨细胞从组织块周边爬出,培养第5天,移出的细胞明显增加,以骨块为中心,向周围呈放射生长,间杂成纤维细胞后期用差异贴壁法分离纯化。7天后细胞基本铺满单层;组织块培养法需10天细胞铺满单层。长满瓶底时,细胞为梭形及立方块状,排列紧密,可见圆形或鳞片形细胞。随着培养时间的延长,成骨细胞可呈多层生长。2.细胞活力测定:台盼蓝染色后,蓝染细胞为死亡细胞。按未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活力的数据,本实验活细胞率95%～99%。3.成骨细胞的鉴定（1） ALP活性染色:细胞钙钴法染色显示呈强阳性,细胞胞浆内可见灰、黑颗粒定位于酶活性之处,证明细胞内有活性ALP的表达。（2）体外矿化能力检测:末次传代的细胞生长至3、4周后细胞呈复层状生长,中心部细胞密集可发生钙化,形成肉眼可见的散在白色点状物。Von Kossa’s法矿化结节染色后,钙盐沉积区域呈黑色,背景红色。4.在体外模拟失重条件下,失重模型组与对照组相比,成骨细胞培养液中ALP、BGP活性均有显著降低（t=17.033,P=0.000;t=7.886,P=0.001）,表明已建立了模拟失重成骨细胞模型。与对照组相比,失重模型组成骨细胞凋亡率显著升高（t=11.214,P=0.000）,说明失重可引起成骨细胞凋亡增加。5.中药复方对体外模拟失重条件下成骨细胞培养液中ALP活性的影响:模拟失重条件下,各培养组间ALP活性有显著性差异（F=82.053,P=0.000）。较之失重模型组,含药血清不同浓度组细胞培养液中的ALP活性均有不同程度升高,其中该方含药血清10%和20%浓度组ALP活性升高显著（P=0.000,P=0.000）。含药血清5%,10%和20%浓度组间两两比较均有显著性差异（P=0.000,P=0.000,P=0.020）。6.中药复方对体外模拟失重条件下成骨细胞培养液中BGP的影响:模拟失重条件下,各培养组间BGP活性有显著性差异（F=18.907,P=0.001）。与失重模型组比较,含药血清不同浓度组细胞培养液中的BGP活性均有不同程度升高,其中该方含药血清20%浓度组BGP活性显著升高（P=0.001）。含药血清10%和20%浓度组间比较有显著性差异（P=0.015）,两者与5%浓度组比较BGP活性均无明显变化（P=1.000,P=1.003）。7.中药复方对体外模拟失重条件下成骨细胞凋亡的抑制作用:模拟失重条件下,各培养组间成骨细胞细胞凋亡率有显著性差异（F=23.971,P=0.000）。与失重模型组比较,含药血清不同浓度组成骨细胞凋亡率均有不同程度降低,其中该方含药血清10%和20%浓度组成骨细胞凋亡率显著降低（P=0.002,P=0.000）。含药血清5%和20%浓度组间比较有显著性差异（P=0.007）,两者与10%浓度组比较成骨细胞凋亡率均无明显变化（P=0.100,P=0.535）。结论1、“两步消化—组织块培养法”原代培养大鼠成骨细胞是一种科学有效的成骨细胞原代培养方法。2、体外模拟微重力培养降低了成骨细胞活性,使骨基质形成、成熟和矿化作用均降低;成骨细胞凋亡率显著增加。3、补肾壮骨中药能有效改善模拟失重条件下成骨细胞的功能,减少成骨细胞凋亡,缓解其分化抑制状态,促进骨基质的形成和成熟。