论文部分内容阅读
目的幽门螺杆菌重要毒力CagA蛋白能上调原癌蛋白CIP2A的表达,本试验在此基础上研究参与其表达的信号分子及其细胞生物学作用,为进一步解析CagA上调CIP2A的表达的分子机制,了解其在胃癌中的作用奠定基础。胃癌转移的机制还不完全清楚,本试验通过动物试验研究胃癌转移前后microRNA的差异表达,筛选胃癌转移相关的microRNA,为进一步解析胃癌转移的相关分子机制及设计靶向治疗胃癌药物奠定理论基础。方法细胞株AGS和GES-1培养好,通过信号抑制剂GDC-0879抑制B-Raf,信号抑制剂SP600125抑制JNK2,再分别用B-Raf的干扰RNA和JNK2的干扰RNA干扰,转染CagA阳性质粒WT-cagA和阴性对照质粒pcDNA3.1后,Western blot检测CIP2A表达,细胞克隆形成试验检测细胞增殖能力,细胞迁移试验检测细胞迁移能力。体外培养低分化人胃腺癌细胞BGC-823,收集细胞注射至裸鼠背部皮下,成瘤后传代,形成的实体瘤继续种于裸鼠胃壁,胃壁种植9-10周后,部分裸鼠的肝脏及肠系膜淋巴结出现胃癌转移灶,成功制备裸鼠胃癌转移模型,获得转移前后胃癌肿瘤组织,分别提取RNA,通过基因芯片分析microRNA的差异表达。结果AGS和GES-1细胞转染CagA阳性质粒WT-cagA后,CIP2A表达上调。用B-Raf和JNK2信号抑制剂和对应的干扰RNA作用,再转染CagA阳性质粒WT-cagA,发现CIP2A表达下调,细胞增殖能力降低,细胞迁移能力亦降低。成功的制备裸鼠胃癌转移动物模型,获取转移前后的肿瘤组织,提取RNA,通过基因芯片在3552个microRNA中,筛选出表达变化的microRNA有849个,与转移有关的差异大于4倍的microRNA有14个,其中表达上调的microRNA有11个,表达下调的microRNA有3个。结论幽门螺杆菌CagA进入细胞通过B-Raf和JNK2分子影响CIP2A的表达,综合目前研究和以前的研究,推测CagA通过Sac→CagA-y-p→Shp-2→Rap-1→B-Raf→Erk-1→P38→JNK途径影响CIP2A的表达。幽门螺杆菌CagA通过B-Raf和JNK2分子影响CIP2A的表达进而影响细胞克隆形成能力和细胞迁移能力。把胃癌细胞注射至裸鼠背部皮下成瘤后传代,形成的实体瘤种于裸鼠胃壁,得到胃壁肿瘤组织及转移到肝和肠的肿瘤组织,成功的制备裸鼠胃癌转移动物模型;在转移前后的胃癌组织中筛选出差异表达的microRNA,最后筛选出与胃癌转移有关的差异大于4倍的microRNA有14个,其中表达上调的microRNA有11个,表达下调的microRNA有3个。