研究背景近年,随着核技术发展,电离辐射成为社会发展过程中的污染因素之一,而人体暴露于大剂量的电离辐射后会引发各种不良生物学效应,因此研制针对电离辐射损伤的辐射防护药物便显得十分重要。近来研究发现,细菌自身的结构成分(如脂多糖,鞭毛蛋白等)能够抑制辐射导致的细胞凋亡,增强机体对辐射的抵抗力。我们实验室前期研究发现给予野生型小鼠TLR4配体细菌脂多糖(lipopolysaccharide,简称LPS)刺激后能提高小鼠对辐射的耐受。LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分之一,它能激活机体的免疫反应。LPS虽有较好的抗辐射效应,但LPS会使感染的机体产生毒性反应。我们通过预实验筛选了大量LPS类似物,发现白细胞趋化肽N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,简称FMLP)可以诱导机体产生与LPS刺激类似的炎症反应。有文献报道FMLP对中性粒细胞、单核细胞等细胞有重要作用,包括粘附,趋化和超氧化物阴离子释放等。这提示FMLP可能通过影响细胞功能、调节机体免疫功能,从而具有潜在的辐射防护作用。基于以上研究背景,我们开展了FMLP对电离辐射防护作用及其机制的初步研究。研究目的1.评价FMLP的毒性效应,并研究FMLP对体外细胞、辐射敏感组织和小鼠的辐射防护效应。2.开展FMLP辐射防护作用的机制研究,初步探寻FMLP抗辐射的分子机制。研究方法1.FMLP的毒性及辐射防护效应研究(1)FMLP毒性效应研究。细胞水平:不同浓度的FMLP作用于人小肠上皮细胞系(HIEC)、C57BL/6小鼠骨髓原代细胞(BMC)、C57BL/6小鼠脾原代细胞(Spleen cell)后,利用CCK-8方法检测细胞活力。动物水平:不同浓度的FMLP经腹腔给药于C57BL/6小鼠,以WR-2721、LPS等已知辐射防护效果较好的试剂作为阳性对照试剂,评价FMLP对在体动物的毒性效果。(2)FMLP对体外细胞的防护效应。通过HIEC/BMC/Spleen cell照后采用CCK-8实验和流式细胞术两种检测方法,检测受照细胞的细胞活力和细胞凋亡率变化,评价FMLP对体外细胞的防护效应。(3)FMLP对辐射敏感组织的辐射防护效应。采用小鼠外周血白细胞计数、骨髓单个核细胞计数、脾脏系数、肠道组织病理切片染色评价FMLP对辐射敏感组织的辐射防护作用。(4)FMLP对在体动物的辐射防护效应。以WR-2721、LPS等已知辐射防护效果较好的试剂作为阳性对照试剂,记录C57BL/6小鼠经不同剂量辐照后的生存期和生存时间评价FMLP对整体动物的辐射防护作用。2.FMLP的辐射防护初步分子机制研究(1)应用多种基因敲除小鼠初步研究FMLP的辐射防护机制。采用野生型(WT)、TLR2敲除(KO)、TLR4 KO、My D88 KO四种小鼠的原代脾细胞和骨髓病理切片研究FMLP的辐射防护作用是否依赖TLRs及其下游信号通路。(2)构建FPR1、FPR2敲低稳转细胞株研究FMLP辐射防护机制。(3)结合参考文献,运用定量PCR研究FMLP对受照小鼠脾脏原代细胞内骨髓造血相关细胞因子IL-6,IL-11,CCL-2,IL-12和GM-CSF等m RNA水平的影响。(4)ELISA法检测小鼠体内细胞因子IL-6,IL-11,CCL-2,IL-12和GM-CSF的表达量。(5)通过RNA sequence技术筛选可能的辐射防护差异基因,而后采取定量PCR等实验技术进一步检测相关基因的表达情况。研究结果1.FMLP毒性及辐射防护效应研究结果(1)FMLP毒性效应研究。CCK-8显示FMLP在16μM以下浓度对HIEC、BMC以及Spleen cell等细胞均无明显毒性,且表现出轻度促进细胞活力的作用,并选取0.5-1μM为最佳给药剂量。在FMLP与WR-2721和LPS这两种辐射防护剂的毒性作用对比检测中,小鼠生存期实验结果表明FMLP的急性毒性介于LPS和WR-2721之间。(2)FMLP对体外细胞的辐射防护效应。细胞照后活力检测显示FMLP对HIEC、BMC、Spleen cell三种细胞活力都有提高;在多种防护剂的效果对比中,FMLP防护效果最好,细胞活力达到80%以上。在流式细胞术凋亡检测中,选取HIEC、BMC、Spleen cell三种细胞实验,结果显示FMLP对三种细胞的存活率都有一定程度提高,其中HIEC细胞的存活率提高20%-30%。(3)FMLP对辐射敏感组织的防护效应。FMLP可显著升高照射后小鼠的外周血白细胞数目和骨髓有核细胞数目,降低小鼠在体BMC凋亡率,提高照后小鼠脾脏脏器指数,FMLP还可以保护骨髓和肠道组织,降低骨髓和肠道细胞凋亡。(4)FMLP对在体动物的辐射防护效应。小鼠生存期结果证明,在不同照射剂量全身照射情况下,照射给药组的生存率比单纯照射组均有延长。通过与阳性对照药物对比显示,FMLP的辐射防护效应高于WR-2721。2.FMLP辐射防护初步分子机制研究结果(1)应用基因敲除小鼠初步研究证实FMLP发挥辐射防护作用不依赖TLRs。(2)构建稳转细胞株研究FMLP辐射防护机制,发现FMLP的辐射防护作用主要通过FPR1。(3)定量PCR结果证明FMLP可以促进受照小鼠脾脏原代细胞内IL-6,IL-11,CCL-2,IL-12和GM-CSF等细胞因子的m RNA转录水平。(4)ELISA实验结果证实FMLP可以上调小鼠体内IL-6,IL-11,CCL-2,IL-12和GM-CSF等因子的体内表达量。(5)通过RNA sequence(测序)在小鼠脾脏细胞中共分析出593个差异表达基因,其中上调基因343个,下调基因250个。之后通过热图,火山图对显著差异基因分析、GO(Gene Ontology)分析和KEGG生物通路富集分析,我们发现Ccnb1、Ccnb2、Cdk1、Mcm2、Mcm7等与细胞周期进展中密切相关的调控因子均有上调,结合参考文献,我们再使用定量PCR实验验证Aurka、Aurkb、Ccnb1、Ccnb2、Cdk1、Mcm2、Mcm7基因表达确有上调。研究结论1.FMLP毒性介于LPS和WR-2721之间。FMLP在体外细胞、辐射敏感组织和在体动物三个层面均发挥了一定的辐射防护作用。2.FMLP的辐射防护作用不依赖TLRs信号通路,主要通过FPR1信号通路。FMLP促进IL-6,IL-11,CCL2,IL-12和GM-CSF等细胞因子的转录,影响照后小鼠体内的免疫反应过程从而发挥辐射防护作用,同时还通过上调小鼠体内Aurka、Aurkb、Ccnb1、Ccnb2、Cdk1、Mcm2、Mcm7等细胞周期进展相关基因发挥辐射防护作用。