S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)均为生物体内重要的含硫小分子活性化合物。SAM由底物L-蛋氨酸和ATP经S-腺苷蛋氨酸合成酶酶促合成,作为代谢中间物质参与生物体内40多种生化反应,具有转甲基、转硫和转氨丙基等作用。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸反应生成的活性三肽化合物,在维持生物体内适宜的氧化还原环境、保护蛋白质的巯基免受氧化、清除细胞内活性氧自由基等方面具有重要的作用。基于SAM和GSH在细胞内的重要生理功能,这两种含硫化合物在临床医学、运动保健、食品加工和化妆品等诸多领域均具有广泛的应用前景。在SAM和GSH生物合成过程中,作为重要的底物之一,能量物质ATP的供给和消耗速率将直接影响SAM和GSH的合成效率。与以往利用诱变技术或基因工程技术对物质代谢过程进行改造的育种方式不同,本论文通过对菌株能量代谢过程进行改造,最终实现SAM和GSH的过量合成。为此,本论文以产朊假丝酵母(Candida utilis CCTCC M 209298)为出发菌株,对其能量代谢过程中的相关基因进行改造,选育SAM和GSH高产菌株,并从分批发酵过程、关键酶活性、能量代谢物质水平及比率和转录组测序等方面分析突变株高产SAM和GSH的生理和分子机制。最后,通过在恒溶氧条件下进行分批发酵,进一步探究能量代谢在SAM和GSH联产发酵过程中的作用。主要研究结果如下:1.利用基因工程手段对C.utilis CCTCC M 209298能量代谢过程中的相关基因进行改造,构建一系列能量代谢改造突变株。首先,构建一个在产朊假丝酵母细胞内具有功能的表达载体,然后克隆拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ATP合成酶ATP6基因和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油醛脱氢酶gap基因,将它们分别连接到表达载体上后电转化产朊假丝酵母,获得ATP6基因过表达菌株C.utilis ATP6和gap基因过表达菌株C.utilis gap。克隆产朊假丝酵母线粒体膜孔蛋白基因por1上下游片段,将它们与标记基因连接后,构建por1基因敲除组件,然后利用该组件对C.utilis CCTCC M 209298、C.utilis ATP6和C.utilis gap菌株的por1基因进行敲除,成功构建C.utilisΔpor1、C.utilis(ATP6Δpor1)和C.utilis(gapΔpor1)菌株。最后在摇瓶培养条件下对所构建的五株突变株合成SAM和GSH的性能进行考察,结果发现只有C.utilisΔpor1菌株胞内SAM和GSH含量增加,SAM和GSH产量达到358.1 mg/L,比对照提高了14.2%。2.在实验室规模的5 L发酵罐上,考察了五株突变株合成SAM和GSH的性能,发现只有C.utilisΔpor1菌株的SAM和GSH合成能力显著提高,SAM和GSH最高产量分别达到243.1 mg/L和294.1 mg/L,分别比出发菌株提高了28.4%和39.1%;SAM和GSH联产总量达到523.1 mg/L,比出发菌株提高了34.9%。进一步地,分析了出发菌株和C.utilisΔpor1的分批发酵过程,发现por1基因敲除能够提高线粒体的基础代谢率,使线粒体合成ATP速率增加,进而提高胞内NADH和ATP水平,同时还能显著提高了SAM合成酶(MAT)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)两种关键酶的活性。采用生物信息学技术对出发菌株和突变株的转录组数据进行分析,结果发现por1敲除会激活或上调亚细胞器中配体结合、催化和蛋白酶调控子等相关基因,同时激活或上调脂肪酸合成代谢通路相关基因以及下调次级代谢物、抗生素以及多种氨基酸合成通路相关基因,这些结果为在分子层面解析C.utilisΔpor1菌株高产SAM和GSH提供了可信的证据。3.在不同恒溶氧条件下,对出发菌株和C.utilisΔpor1合成SAM和GSH的联产发酵过程进行考察。结果发现,无论是出发菌株还是por1基因敲除菌株,当溶氧水平恒定控制在30%时,SAM和GSH的联产量均达到最大,出发菌株的SAM和GSH联产量达到456.8 mg/L,比恒转速350 r/min时提高了11.9%;突变株的SAM和GSH联产量达到514.2 mg/L,比恒转速时提高了11.8%。进一步地,对30%恒溶氧条件下的SAM和GSH高产机制进行研究,结果发现,出发菌株主要通过提高胞内ATP水平以及γ-GCS酶活性,显著提高胞内GSH含量来增加SAM和GSH产量;而突变株除了提高胞内ATP水平和MAT酶活性外,在发酵后期还能增加胞内NADH含量,为SAM的过量合成提供充足的能量物质,有利于SAM的过量合成,进而提高SAM和GSH的联产产量。