研究背景:急性髓系白血病(AML)是一组临床和生物学行为存在高度异质性的疾病,AML的发生是由于髓系白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻,但其具体病因和发病机制尚未完全清楚。随化疗方案的不断改进,AML完全缓解(CR)率可达80%左右,但大部分患者会复发,即使行造血干细胞移植仍有30%患者会复发,治疗效果有待进一步提高。就白血病现有的治疗模式而言,化疗经过多年的发展和演变,已很难再显著提高疗效,必须发展新的治疗策略才能改善总体预后,白血病的生物靶向治疗和免疫治疗是最新AML治疗研究的热点。寻找新的与AML发病密切相关的基因,开发新的靶向治疗药物可望进一步提高疗效。脑和急性白血病胞浆(BAALC)基因作为新发现的、正常核型AML(NC-AML)患者最有意义的预后指标和潜在的治疗靶点之一,应用前景广阔。BAALC基因定位于染色体8q22.3,全长89Kp,正常情况下,BAALC仅在神经外胚层来源组织和早期造血细胞表面表达,而在正常人骨髓和成熟外周血细胞表面不表达或极低表达。其DNA序列高度保守,所编码的蛋白与目前已知的其他功能蛋白无任何同源性。在白血病方面,进一步研究发现,BAALC的表达与急性白血病,特别是AML存在密切联系。Baldus等研究发现BAALC基因在部分AML、ALL和CML急变期(CML-BP)患者高表达,而在CML慢性期(CML-CP)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)不表达,因此推测BAALC基因可能与AML和ALL发生密切相关。Bienz等报道正常核型AMLN患者中70%存在BAALC基因显著高表达,且BAALC表达量与NC-AML预后关系密切,BALLC表达量越高,AML患者预后越差。Baldus等也报道了BAALC高表达的AML患者其无病生存期(DFS)和总生存期(OS)明显缩短。多变量分析也表明,BALLC是独立于FLT-ITD、MLL-TD外的,在NC-AML中最具意义的预后因素之一,与低表达病例相比,耐药率、累计复发率明显增高,死亡的危险度高2.7倍。我们前期工作通过实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测AML患者BAALC基因的表达,也发现大部分初治AML可出现BAALC的高表达,而正常对照组未检出BAALC的表达,正常核型初治AML高表达BAALC者化疗CR率显著低于低表达者,OS更短,预后更差。由于BAALC与AL的研究尚处于起步阶段,目前关于BAALC基因和蛋白的功能、BAALC在AL发病和难治复发中作用的分子机制、上下游转录调控网络及其信号传导通路尚未清楚,能否通过抑制BAALC的表达发挥抗白血病作用,在国内外均未见相关文献报道。长期以来,对基因功能的研究主要依赖基因敲除和反义核酸技术等方法,基因敲除存在操作复杂、周期长等问题,而反义核酸技术特异性不强、效率不高,均不适于大规模的基因功能研究。近年来发现一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内某些基因致使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干涉(RNAi)。RNAi主要优点是逆基因分析,即已知特定的基因序列,通过阻抑这一特异基因的表达而出现功能和个体表型的改变,进而得到基因与其功能的对应联系。此外该技术还具有特异、高效、快速及对靶RNA的切割位点确定性、高稳定性和高穿透性等特点。由于RNAi技术操作的简单性和对靶基因表达抑制的高效性使其成为基因功能研究的有力手段。研究目的:通过RNA干扰(RNAi)技术沉默BAALC基因的表达,建立稳定沉默的AML细胞系,研究BAALC基因在急性髓系白血病发病机制中的作用。研究方法:1.合成靶向干扰BAALC基因表达的寡核甘酸序列,退火得到短发卡,与酶切的RNAi表达载体相连接,转化大肠杆菌DH-5α,蓝白斑筛选阳性克隆,提取质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳和序列测定,验证重组质粒载体序列,构建靶向BAALC的RNAi表达载体。2.重组载体以脂质体转染的方法导入表达BAALC基因的人AML细胞株Kasumi-1细胞和KG1a细胞,荧光显微镜观察GFP表达情况,流式细胞术(FACS)检测转染效率,G418后筛选阳性克隆细胞株,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot,验证干扰效果,得到稳定沉默的细胞株。3.统计学分析:用SPSS 13.0软件包处理,P≤0.05表示差异有显著性意义。研究结果:1、退火得到shRNA经琼脂糖凝胶电泳100bp处可见单一电泳条带说明Oligo单链退火成功。取pGPU6/GFP/Neo空质粒,以BamHⅠ、BbsⅠ限制性内切酶进行双酶切,37℃酶切过夜,酶切产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见5kb处和57bp处有两条电泳条带,说明质粒提取、酶切成功,经切胶纯化后可用于下步连接反应。可用于后续连接载体。纯化产物与退火产物相连接后转化转化大肠杆菌DH-5α,蓝白斑筛选阳性克隆,提取质粒DNA再次进行酶切电泳鉴定和DNA序列测定,验证重组质粒载体序列无误,成功构建靶向BAALC的RNAi表达载体。2、细胞转染48h后进行荧光显微镜观察GFP表达情况,可见部分细胞呈GFP阳性,说明转染成功,重组的shRNA表达载体成功导入人髓系白血病细胞株内。转染48h收集细胞,PBS洗涤后以流式细胞术(FACS)检测GFP表达情况,并计算转染效率。对4μl和2μl转染组进行转染效果比较,发现2μl转染组的GFP表达阳性率(5%)要高于4μl转染组(3%),说明2μl组转染效果更好,后续实验取优化的2μl体系进行转染。3、在RNA干扰前后,提取细胞总RNA进行半定量RT-PCR验证干扰效果,发现干扰后内对照GAPDH基因的转录水平比干扰前显著下调,实验组细胞中BAALC基因在转录水平也被不同程度抑制,与空白对照组相比,实验组BAALC基因的mRNA转录水平下降了60～70%以上。说明构建的重组质粒载体顺利导入白血病细胞株体内,在转录水平能顺利表达,与靶序列相结合,发生RNAi作用。4、在RNA干扰前后,提取细胞总蛋白进行Western blot实验验证蛋白水平的干扰效果,Band Scan图像分析软件对条带吸光度进行半定量分析。Westernblot结果显示在RNA干扰后,GAPDH蛋白表达显著降低,实验组细胞中BAALC的蛋白表达被明显抑制,约40～60%。提示重组载体能充分发挥RNAi作用,下调BAALC表达。干扰效果可能存在细胞系列的差异。结论:成功构建了靶向干扰BAALC基因的siRNA表达载体,用脂质体转染方法可成功导入人AML细胞株中,经G418筛选后得到稳定沉默BAALC基因表达的人AML细胞株,以第2个干扰位点的下调BAALC基因表达的效果最为明显。可选择第2个位点稳定下调BAALC基因表达的细胞株研究其对人AML细胞增殖、分化、凋亡的影响。