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目的:糖尿病是一组以血糖水平持续增高为特征,由胰岛素分泌或作用缺陷所引起的代谢性疾病。糖尿病慢性并发症累及全身多个组织器官,包括心血管系统、肝脏、肾脏、神经系统等。非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是糖尿病常见的并发症。NAFLD会干扰糖尿病的血糖控制,加速糖尿病微血管并发症的发生和发展。有研究发现胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、氧化应激等因素在其发病机制中发挥了重要作用。黄连素是从中药黄连中提取的有效成分,近年来研究发现该药尚能治疗血脂异常、高血糖、高血压及心律失常等疾病,关于黄连素对糖尿病NAFLD的研究越来越受关注。本研究通过高脂饲料加低剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,连续给药20周后,观察黄连素对模型大鼠肝脏的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:1.黄连素对2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用采用高脂饲料加低剂量链脲佐菌素腹腔内注射方法,建立2型糖尿病大鼠模型,将大鼠随机分为正常组、模型组和黄连素组。造模成功后连续给予黄连素灌胃20周。实验在第20周结束时动物取材,收集血清用于血生化检测;收集肝脏组织,用于病理学观察及机制研究。2.黄连素对2型糖尿病大鼠肝脏AMPK通路介导的脂质代谢的影响通过实时荧光定量PCR方法检测各组大鼠肝组织中AMPK通路的脂质代谢相关基因AMPK、ACC、FAS和CPT1在mRNA水平的表达情况;通过免疫组织化学检测磷酸化AMPK(pAMPK)、磷酸化ACC(pACC)、FAS和CPT1在蛋白水平的表达;通过Western Blot方法检测pAMPK、pACC、FAS及CPT1在蛋白水平的表达情况。3.黄连素对2型糖尿病大鼠肝脏Nrf2通路介导的氧化应激反应的影响测定各组大鼠肝组织氧化应激指标:SOD、CAT和GSH-Px的活性及MDA的水平;通过实时荧光定量PCR方法检测Nrf2信号通路的相关基因(Nrf2、Keap1、SOD、CAT、GSH-Px、NQO1和HO1)在mRNA水平的表达情况;通过免疫组织化学检测Nrf2、Keap1、SOD、CAT、GSH-Px、NQO1和HO1氧化应激反应相关蛋白的表达情况;通过Western Blot的方法检测Nrf2、Keap1、SOD、CAT、GSH-Px、NQO1和HO1在蛋白水平的表达情况。结果:1.黄连素对2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用模型组大鼠从实验第4周起到第20周结束,体重显著低于正常组(P<0.05);黄连素组大鼠体重较模型组没有形成显著性差异,但肝重指数显著降低(P<0.05)。模型组大鼠血糖、血脂和肝功水平与正常组相比也显著升高(P<0.05),黄连素能明显降低模型大鼠的血脂和肝功水平(P<0.05)。HE和油红O染色结果显示黄连素可以有效降低模型大鼠的肝组织炎性细胞浸润及脂质沉积,说明黄连素可改善由高脂喂养加低剂量链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠的肝损伤。2.黄连素对2型糖尿病大鼠肝脏AMPK通路介导的脂质代谢的影响实时荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肝组织中AMPK、CPT1的mRNA表达量有显著下调(P<0.01),而ACC、FAS的mRNA表达呈现显著增加(P<0.01);与模型组相比,黄连素组大鼠肝组织中AMPK、CPT1的mRNA表达量有所增加(P<0.05),ACC、FAS的mRNA表达量均明显下调(P<0.05)。免疫组化法检测结果显示,与正常组相比模型组大鼠肝组织中,pAMPK、pACC和CPT1的蛋白相对含量低表达(P<0.001),FAS表达显著增加(P<0.001);黄连素组较模型组pAMPK、pACC和CPT1的蛋白相对含量表达明显升高(P<0.05),FAS的表达有显著下降(P<0.001)。Western Blot结果显示,与正常组相比模型组大鼠肝组织中,pAMPK、pACC和CPT1的蛋白相对含量低表达(P<0.05),FAS高表达(P<0.01);而黄连素组肝组织中pAMPK、pACC和CPT1蛋白相对含量表达较模型组显著升高(P<0.05),FAS表达显著性降低(P<0.01)。3.黄连素对2型糖尿病大鼠肝脏Nrf2通路介导的氧化应激反应的影响与正常组比较,模型组大鼠肝组织匀浆中SOD、CAT、GSH-Px活性明显降低,MDA的水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,黄连素组大鼠肝组织匀浆中SOD、CAT、GSH-Px活性显著性升高,MDA的水平明显降低(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,模型组抗氧化转录因子Nrf2及其调控的下游基因CAT、GSH-Px及HO1的mRNA水平有明显下降(P<0.01);与模型组相比,黄连素组可明显提高模型大鼠肝组织中Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px和HO1的mRNA的表达(P<0.05)。免疫组化法检测结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肝组织中,Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px及HO1的蛋白相对含量低表达(P<0.05);黄连素组较模型组Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px及HO1的蛋白相对含量表达明显升高(P<0.05)。Western Blot结果显示模型组大鼠肝组织中,Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px、NQO1及HO1的蛋白含量呈低表达;而黄连素可以显著提高模型动物肝组织中Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px及HO1的蛋白含量(P<0.05),减缓了氧化应激对肝脏造成的损伤。结论:1.研究发现黄连素治疗20周后,可显著降低模型大鼠的ALT、AST、TC、TG及LDL-C水平,明显改善肝组织病理损伤,表现出良好的肝保护作用。2.黄连素可能是通过上调2型糖尿病大鼠肝脏组织中AMPK、CPT1的mRNA的表达,下调ACC、FAS的mRNA的表达;上调pAMPK、pACC和CPT1蛋白的表达,下调FAS蛋白的表达,降低了脂质合成,促进了脂肪酸氧化,减少脂肪沉积对肝脏的损伤。3.黄连素可能是通过增加Nrf2的mRNA及蛋白表达,上调其下游抗氧化分子SOD、CAT、GSH-Px和HO1的mRNA与蛋白的表达,从而减轻了氧化应激造成的肝损伤,起到对肝脏的保护作用。