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目的:结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第三位[1],其治疗手段与其它肿瘤一样有手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗、基因治疗及中医药治疗等。由于手术治疗无法根治而放射疗法有很强的副作用,基因靶向治疗带来的副作用很小,成为治疗肿瘤的新手段。近年来研究发现,在遗传物质不变的情况下,蛋白质修饰能够影响基因组的稳定性,最终导致肿瘤的发生。其中乙酰化[2]和磷酸化[3-4]修饰在其中起至关重要的作用,那么研究两个修饰之间的相互作用就成为近几年研究的热点。去乙酰化酶SIRT2作为sirtuins家族的主要成员之一在有丝分裂进程的调节[5],氧化应激反应[6],代谢[7],微管稳定性[8],细胞迁移[9],凋亡[10],神经毒性[11-12]以及抑制分化[7,13]中起到重要作用。SIRT2主要定位于细胞质中,但在G2/M转换过程中,SIRT2可以入核,先前有研究报道当抑制SIRT2,FoxO1的乙酰化水平升高,乙酰化状态的FoxO1与ATG7结合,作为E1样泛素化连接酶的ATG7,通过影响细胞自噬导致细胞死亡。这为开发SIRT2抑制剂靶向治疗结肠癌提供了理论依据[14]。染色质结构维持蛋白1（SMC1）是我们通过质谱技术发现的一个SIRT2新的底物。在姐妹染色单体的粘附,染色质压缩,基因计量补偿,细胞周期调节以及DNA损伤修复中具有重要作用[15-16]。而SMC1 Ser 957以及Ser 966的磷酸化是SMC1行使功能的重要表现行使,但有关SMC1的乙酰化/去乙酰化修饰方面的研究尚未被报道,乙酰化与磷酸化之间的调控更未见任何报道。本研究以蛋白质之间的互作为前提条件,在证实了SIRT2与SMC1在体内外均有相互作用基础上,探讨了氧自由基压力下,SIRT2是如何去乙酰化SMC1而影响SMC1的Ser 957以及Ser 966磷酸化水平,以及这一通路在结肠癌中起到何种作用。同时我们生产SIRT2去乙酰化SMC1位点的特异抗体,并且利用该抗体进一步验证SIRT2对SMC1的去乙酰化调控,且通过外源转染人结肠癌细胞系HCT116该位点的活性形式以及磷酸化激活型乙酰化位点激活形式后检测G2/M周期,凋亡等生物学功能,再进一步利用体内裸鼠成瘤探究该位点对于肿瘤增殖的作用,这一研究为肿瘤的靶向治疗提供新思路。研究方法:本研究首先利用质谱技术发现了SIRT2与SMC1具有相互作用。在氧自由基压力下,免疫共沉淀进一步证实SIRT2与SMC1互作增强。那么接下来我们证实SIRT2与SMC1不仅存在互作,且SMC1作为SIRT2底物,可以被去乙酰化。首先利用体内免疫共沉淀实验证明SMC1是乙酰化蛋白,随后利用TSA,NAM处理后,SMC1的乙酰化水平升高,证实SMC1可以被HDAC家族调控。接着利用免疫共沉淀证实SIRT2能够去乙酰化SMC1,且在氧自由基压力下,SIRT2表达升高同时SMC1乙酰化水平下降。而通过外源转染SIRT2催化活性死型质粒,证实SMC1能够被去乙酰化确实依赖于SIRT2的活性区域。为了更直接证明SIRT2对SMC1的去乙酰化机制,我们利用Cell signaling technology（CST）,Phosphosite plus数据库网站提供的SMC1潜在的乙酰化位点为依据,构建了SMC1乙酰化位点死型的质粒转染到细胞中,利用免疫共沉淀找寻SIRT2去乙酰化SMC1的潜在位点。随后我们证实CBP是SMC1的乙酰基转移酶,并且二者有强烈互作。接下来为了证实SIRT2对SMC1去乙酰化修饰促进SMC1磷酸化的发生。首先,在氧自由基压力下,当SIRT2缺失以及催化活性丧失、外源转染CBP以及利用HDAC抑制剂情况下,利用WB技术检测SMC1磷酸化水平。为了探求SIRT2对SMC1的去乙酰化位点在细胞周期G2/M以及细胞凋亡生物学功能中的作用,利用外源转染人结肠癌细胞系HCT116该位点的活性形式以及磷酸化激活型乙酰化位点激活形式后检测G2/M周期指标,凋亡指标等生物学功能,最后将上述质粒外源过表达HCT116-shSMC1筛选并鉴定该稳转细胞系,随后皮下注射裸鼠,利用体内成瘤探究该位点对于肿瘤增殖的作用。结果:1、生理条件下,SIRT2与SMC1具有互作,且氧自由基压力下互作增强。2、SMC1是乙酰化蛋白,HDAC抑制剂能够使得SMC1乙酰化水平升高。3、SIRT2是SMC1的去乙酰化酶,且在氧自由基压力下,SIRT2表达升高,SMC1的乙酰化水平降低,并且SIRT2对SMC1的去乙酰化位点是Lys579,随后我们生产了这三个位点的特异性抗体,特异性良好,可以用于后续实验。4、CBP是SMC1的乙酰基转移酶,二者存在互作。5、氧自由基压力下,SIRT2表达量以及活性的缺失使SMC1磷酸化水平降低,两种修饰呈负相关。6、氧自由基压力下,SIRT2通过其去乙酰化酶活性提高SMC1-P水平。7、外源转染人结肠癌细胞系HCT116-shSMC1 K579的活性形式K579Q与WT以及S957DS966DK579Q相比细胞周期G2/M周期阻滞增加,凋亡升高。8、利用体内裸鼠成瘤证实HCT116-shSMC1-K579Q肿瘤增长速度最慢,K579Q具有抑制肿瘤增殖的作用为肿瘤的靶向治疗提供了新的理论依据。结论:1、SIRT2对粘连蛋白SMC1去乙酰化修饰位点是第579位的赖氨酸。2、氧自由基压力下,SIRT2对SMC1去乙酰化修饰增强了ATM激酶与SMC1结合,最终促进了其磷酸化的发生。3、抑制SIRT2去乙酰化SMC1降低其磷酸化的发生能抑制结肠癌增殖速率。