脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）是一种重要的人畜共患病病原,宿主广泛,能引起脑炎,心肌炎,糖尿病,生殖系统疾病等疾病,并且能跨种间传播,严重危害养猪健康与公共卫生安全。胆固醇25-羟化酶（CH25H）是一种由重要的干扰素刺激基因（ISG）编码的多聚异位膜蛋白,可将胆固醇氧化成25-羟基胆固醇（25HC）,研究显示CH25H和25HC具有广谱的抗病毒活性,可以抑制多种囊膜病毒和非囊膜病毒,但是目前其对EMCV复制的影响及机制尚不清楚。本研究通过荧光定量PCR（qPCR）的方法检测EMCV感染BHK-21和N2A细胞后不同时间点CH25H的变化,构建了 CH25H真核表达质粒,通过体外转染,检测其对EMCV复制的影响,为研究EMCV的感染和复制机制以及CH25H的抗病毒作用机制奠定了基础。具体的研究内容如下:1.CH25H抑制EMCV在BHK-21中复制及其分子机制采用EMCV感染BHK-21细胞,通过qPCR检测在感染后细胞内CH25H的mRNA水平,结果显示EMCV在感染细胞后可以显著促进CH25H mRNA转录,说明EMCV可以诱导BHK-21细胞中CH25H基因表达。在BHK-21上通过转染真核表达质粒或si RNA干扰片段调节CH25H表达,利用Western blot,间接免疫荧光（IFA）和qPCR方法解析CH25H对EMCV复制的影响,结果显示CH25H以剂量依赖方式显著地抑制EMCV在BHK-21中的复制。通过构建酶活性缺失的突变体CH25H-M,将其转染到BHK-21内,发现突变体CH25H-M抑制EMCV的活性显著降低了。另外,本研究发现酶活性产物25HC也具有明显抗EMCV的活性。随后我们研究了 25HC对EMCV复制周期的影响,通过对病毒粒子吸附,入胞,基因组复制和释放的各环节分析,发现25HC可以明显地抑制EMCV的入胞和基因组复制。进一步通过将CH25H蛋白与病毒蛋白共转染,发现CH25H可以降解EMCV的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp,3D蛋白）,采用激光共聚焦和免疫共沉淀试验（Co-IP）证明CH25H与3D蛋白发生特异性互作,并且定位在胞质中。上述结果表明,CH25H可以通过产生25HC来抑制EMCV的入胞和基因组复制,同时CH25H还可以通过降解3D蛋白,影响RNA聚合酶进而抑制病毒复制。2.CH25H抑制EMCV在N2A细胞中复制及其分子机制N2A细胞系是小鼠脑神经瘤细胞,通常作为体外病理研究的细胞模型。为了研究CH25H对N2A细胞中EMCV感染的影响,采用qPCR检测EMCV感染后细胞内CH25H的mRNA水平,发现EMCV感染可引起N2A细胞内CH25H转录水平上调,并于16h后上调效果最明显,说明EMCV可以诱导N2A细胞中CH25H基因表达。在过表达CH25H的N2A细胞上研究其对EMCV复制的影响,利用Western blot,qPCR和病毒滴度测定实验（TCID50）分析EMCV复制情况,结果显示CH25H能够以剂量依赖方式显著地抑制EMCV在N2A细胞上复制。通过转染酶活性缺失的突变体CH25H-M,发现突变体修复了抑制EMCV复制的能力。另外,本研究用25HC处理N2A细胞,发现25HC也可以显著的降低EMCV的病毒滴度。随后我们用qPCR和Western blot方法分析25HC对EMCV吸附,入胞,基因组复制和释放的四个环节,发现25HC可以明显地抑制EMCV进入N2A细胞和基因组的复制。上述结果表明,CH25H和25HC均可显著抑制N2A细胞中的EMCV感染,进一步研究发现25HC通过抑制病毒粒子入胞和基因组复制从而抑制EMCV在N2A细胞上复制。