背景2018年全球癌症统计报告显示,肝癌为发病率排名第五,死亡率排名第三的癌症,每年有肝癌死亡病例782000例,其中有近五成来自中国。按病理类型分类,原发性肝癌中最常见的为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),HCC患者占到肝癌总数的75%~85%。目前,HCC的标准治疗手段包括肝切除术、肿瘤局部消融、肝移植、化疗和靶向治疗,但疗效有限,接受手术治疗的HCC患者5年肿瘤复发率仍高达70%,因此迫切需要寻找HCC相关的致癌基因,用于对患者进行精准治疗,改善其预后不良的情况。HCC是由体细胞基因组突变(乘客型和驱动型突变)的积累和表观遗传修饰所引起的,其分子异质性很大。大量证据表明,异常表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在HCC的发生发展中起重要调控作用。已有很多证据表明,lnc RNAs(如lnc SOX4、LINC001138、lnc-UCID和TSLNC8等)的失调与HCC细胞的增殖、转移、上皮细胞间充质转化、血管生成丰富和细胞耐药性增加等相关,还会对HCC细胞干性产生影响。随着高通量测序技术(如宏基因组二代测序法)的发展,实现了对人类基因组前所未有的高分辨率的大规模研究。目前,通过高通量测序得到LINC01419在HCC组织中高表达,但其在HCC细胞中发挥的生物学功能及作用机制仍有待研究。故本研究将从临床、功能、机制和动物实验四个方面分析LINC01419对HCC发生发展的作用,为寻找治疗HCC的靶标提供新的可能。目的1.探究LINC01419在患者HCC组织和不同HCC细胞系中的表达情况,并研究HCC患者组织中LINC01419表达与其病理学特征的相关性,进而为HCC的临床治疗提供新的方向。2.明确在体外LINC01419表达对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的作用。3.阐释LINC01419作用于HCC细胞生物学功能的分子机制。4.探索在裸鼠体内LINC01419表达对HCC细胞增殖和转移功能的作用及其分子机制。方法1.通过对TCGA数据库资料的生物信息学分析,得到在HCC中差异表达的长链非编码RNA;采用实时定量荧光RT-PCR检测LINC01419在40例HCC患者癌及癌旁组织,人正常永生肝细胞系(MIHA)和HCC细胞系(Huh7、SMMC7721、SK-Hep1、Hep G2和Hep G3B)的表达差异。收集40例HCC患者的相关临床病理学指标,统计分析其与患者组织中LINC01419表达水平的关系。通过编码蛋白质能力评价软件(CPAT和CPC),分析LINC01419的编码蛋白能力。采用核质分离试剂盒对HCC细胞进行亚细胞结构分离,通过q RT-PCR检测得到LINC01419的细胞定位,并使用lnclocator软件验证。2.构建稳定过表达LINC01419和干扰LINC01419的HCC细胞系,通过q RT-PCR验证在HCC细胞中过表达或干扰LINC01419的效率。采用MTS实验、Ed U实验、克隆形成实验和流式细胞术检测LINC01419对HCC细胞增殖能力的影响,采用划痕实验和Transwell小室(铺胶/不铺胶)实验检测LINC01419对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。3.使用稳定干扰LINC01419的HCC细胞系,采用转录组测序技术得到表达量变化的基因,应用q RT-PCR确认候选靶基因的表达水平,并筛选出差异最显著的作为待研究的靶基因。应用q RT-PCR和Western blot检测在HCC细胞中过表达或干扰LINC01419后,靶基因NDRG1 m RNA及蛋白表达水平的改变情况。应用q RT-PCR、Western blot和免疫组织化学实验检测靶基因NDRG1在HCC患者癌及癌旁组织、人正常肝细胞系和HCC细胞系中的表达差异,并分析40例HCC患者LINC01419与NDRG1表达的相关性。构建NDRG1过表达质粒,通过MTS实验、Ed U实验、克隆形成实验、划痕实验和Transwell小室(铺胶/不铺胶)实验验证NDRG1在HCC细胞中的生物学功能,并探究将其与干扰LINC01419质粒共转染HCC细胞系后,作用于HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的情况。构建NDRG1启动子区域不同长度截短片段(以500 bp为单位)的双荧光素酶报告基因质粒,在293T和SMMC7721细胞中,采用双荧光素酶报告基因实验检测LINC01419对NDRG1启动子活性的影响。4.使用LINC01419稳定过表达或干扰的HCC细胞系,构建裸鼠皮下成瘤和肝脏原位转移模型。裸鼠皮下成瘤组,每4天对裸鼠皮下肿瘤体积进行测量,注射28天后,处死裸鼠,取肿瘤称重,进一步使用免疫组化和Western blot检测皮下肿瘤组织中NDRG1和Ki67的蛋白表达水平。肝脏原位转移组,56天后处死裸鼠,取其肝、肺组织后拍照,计数肝组织表面结节数及肺转移数,并通过HE染色分析转移情况。结果1.LINC01419在患者HCC组织和不同HCC细胞系中较对照组表达显著升高,LINC01419在HCC患者组织中的表达水平与患者的HCC肿瘤大小(P=0.025)、TNM分期(P=0.027)和血管侵袭(P=0.022)呈正相关,而与患者年龄、性别、血清AFP含量、HBV/HCV抗原和肝硬化等无显著相关性(P>0.05)。LINC01419不具有编码蛋白的能力,主要分布在HCC细胞的细胞质中。2.在HCC细胞中过表达LINC01419对HCC细胞的增殖、迁移和侵袭功能有促进作用,而干扰LINC01419对其增殖、迁移和侵袭功能有抑制作用。3.通过细胞转录组测序得到在m RNA水平发生显著改变的基因,从中选出与HCC细胞增殖和转移功能相关的14个靶基因,其中靶基因NDRG1在HCC细胞中干扰LINC01419后下调最为显著。NDRG1在人HCC组织和HCC细胞系中呈现高表达,HCC患者组织中LINC01419与NDRG1表达呈正相关。在HCC细胞中过表达NDRG1可促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭功能,而在细胞中共转染干扰LINC01419后可阻断该作用。LINC01419可通过影响NDRG1启动子的-1000~-500 bp区域,增强该启动子的活性。4.裸鼠皮下成瘤模型中,过表达LINC01419组皮下肿瘤体积和重量较对照组显著增大,且其HCC组织中NDRG1和Ki67的蛋白表达水平显著上调,而干扰LINC01419组得到相反的实验结果。裸鼠肝肺转移模型中,过表达LINC01419组肿瘤肝肺转移较对照组显著增多,而干扰LINC01419组得到相反的实验结果。结论1.LINC01419是一种长链非编码RNA,从临床特征上表现出促进HCC发生发展的作用。2.体外细胞实验表明LINC01419对HCC细胞的增殖、迁移和侵袭功能有促进作用。3.分子机制研究证实LINC01419可以通过增强NDRG1启动子的活性,使NDRG1的表达增加,进而促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭作用。4.动物实验揭示LINC01419对HCC细胞的增殖和转移有促进作用,体内验证LINC01419能通过增加NDRG1表达,从而促进HCC发生发展。本研究结果为LINC01419靶向HCC的治疗提供了一定的理论依据。