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目的:检测三黄煎剂的主要成分,构建合理的质控体系;建立他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞系;检测三黄煎剂对他莫昔芬耐药细胞系生物行为学的影响;探寻三黄煎剂的可能的作用靶点。方法:1.使用高压液相方法检测三黄煎剂的三种单体的成分,在波长260nm处检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷,在波长430nm处检测姜黄素,在波长254nm处检测大黄素。2.使用CCK-8的实验方法检测细胞增殖抑制实验,检测不同浓度的4-OH他莫昔芬对乳腺癌MCF-7的抑制能力以及其对MCF-7他莫昔芬耐药细胞的抑制能力,二者IC50之比即为耐药指数,同时也使用该方法检测三黄煎剂对他莫昔芬耐药细胞的抑制作用。3.使用Hoechst 33258染色的方法观测凋亡情况,直观的显示在不同4-OH他莫昔芬的浓度之下,MCF-7和MCF-7他莫昔芬耐药细胞凋亡的情况。4.使用流式细胞仪检测的方式检测不同药物的不同浓度对不同细胞的细胞周期的影响。5.使用transwell实验法检测在不同药物干预情况下,对他莫昔芬耐药细胞迁移和侵袭能力的影响。6.使用管腔形成的实验方法检测不同药物对他莫昔芬耐药细胞的血管新生能力的影响。7.使用鸡胚实验,在体内检测三黄煎剂对他莫昔芬耐药细胞对血管新生能力的影响。8.使用Western blot的方法检测PI3K信号通路以及迁移、侵袭和血管新生相关蛋白的表达。结果:1.我们通过高压液相的方法检测了三黄煎剂中的三种主要成分,复方制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度约为3 1 8±9.6μg·mL-1,姜黄素浓度约为25±1.67μg·mL-1,大黄素浓度约为22±2.43μg·mL-1。在后续的基础实验中,我们将以此作为三黄煎剂的质控标准。2.通过检测48h不同浓度4-OH他莫昔芬对乳腺癌MCF-7他莫昔芬耐药细胞的增殖抑制作用和48h不同浓度4-OH他莫昔芬对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用,发现48h时,4-OH他莫昔芬对MCF-7细胞的IC50值为2.48±1.06μM,对MCF-7/tamR细胞的IC50值为3 2.73±2.19μM。按照耐药指数的公式计算所得,MCF-7/tamR细胞的耐药指数为13.19±2.35倍。细胞周期的检测进一步验证是否成功构建MCF-7他莫昔芬耐药细胞,实验结果显示,在0-5μM浓度的4-OH他莫昔芬的干预48h的情况下,MCF-7细胞在GO/G1期的百分比从52.42±4.21%至83.49±1.62%,提示4-OH他莫昔芬能够诱导乳腺癌细胞MCF-7细胞阻滞在G0/G1期,这与文献报道相一致。而对于同等浓度的4-OH他莫昔芬的干预48h的情况下,对MCF-7他莫昔芬耐药细胞而言,并没有明确的周期阻滞,由此可以认为,在该浓度下的4-OH他莫昔芬对MCF-7他莫昔芬耐药细胞是没有周期阻滞作用的。可以从这个侧面进一步验证所构建的MCF-7他莫昔芬耐药细胞有一定的耐药性。同时Hoechst 33258染色检测凋亡的实验结果显示,对于MCF-7细胞而言,随着4-OH他莫昔芬的浓度增加,细胞的荧光强度增加,同时核裂解和核固缩的情况也进一步增加,显示凋亡程度随着4-OH他莫昔芬浓度的增加而增加,但是对MCF-7他莫昔芬耐药细胞而言,随着4-OH他莫昔芬的浓度增加,凋亡程度并没有太大的变化。因此通过上述三个实验可以判定已成功建立了乳腺癌他莫昔芬耐药的细胞。3.通过Western Blot法检测MCF-7他莫昔芬耐药细胞PI3K信号通路的表达发现,MCF-7他莫昔芬耐药细胞PI3K、AKT以及mTOR的表达明显高于MCF-7细胞组。在之后,随着PI3K信号通路的激动剂和抑制剂的使用,进一步的验证,MCF-7细胞在使用PI3K信号通路激动剂后,其PI3K通路蛋白的表达水平基本与MCF-7他莫昔芬耐药细胞相一致,而MCF-7他莫昔芬耐药细胞所高表达的PI3K信号通路相关蛋白表达,也能够被PI3K信号通路抑制剂所抑制。因此我们可以认为,乳腺癌MCF-7他莫昔芬耐药机制之一是PI3K信号通路过度激活。4.三黄煎剂对乳腺癌MCF-7他莫昔芬耐药细胞具有良好的抑制效果,并呈现时间和浓度依赖。CCK-8结果显示,在一定的作用时间和范围内,三黄煎剂对MCF-7他莫昔芬耐药细胞的抑制率随浓度上升而上升,并且,在同一药物浓度下,三黄煎剂对MCF-7他莫昔芬耐药细胞的抑制率随着时间的增加而增加。因此三黄煎剂对乳腺癌MCF-7他莫昔芬耐药细胞的抑制率与时间和浓度正相关。同时,在Omg/ml,4mg/ml和8mg/ml的三黄煎剂干预24h后,MCF-7他莫昔芬耐药细胞在S期的百分比从38.32±2.14%至56.71±3.62%,提示三黄煎剂能够诱导乳腺癌MCF-7他莫昔芬细胞阻滞在S期,其相应的周期蛋白CDK2和cyclinA,随着三黄浓度的不断增加,蛋白表达也得到了进一步的下降。5.三黄煎剂对MCF-7他莫昔芬耐药细胞的迁移、侵袭能力和血管新生能力有一定的抑制作用,且随浓度增加而增加。6.三黄煎剂降低MCF-7他莫昔芬耐药细胞PI3K信号通路、迁移、侵袭以及血管新生的相关蛋白表达,且随三黄煎剂浓度的增加,蛋白表达进一步降低。7.三黄煎剂降低MCF-7他莫昔芬耐药细胞迁移、侵袭和血管新生的能力与三黄煎剂降低PI3K信号通路的能力密切相关,其作用靶点为PI3K信号通路。8.鸡胚实验中,三黄煎剂能够抑制他莫昔芬耐药细胞所导致的鸡胚尿囊膜的血管新生。相较于空白对照组,他莫昔芬耐药细胞组的鸡胚尿囊膜的微小血管增值率为82.68±7.22%,而相较于空白对照组,给予三黄煎剂的他莫昔芬耐药细胞组的鸡胚尿囊膜的微小血管增值率为50.56±6.48%(P<0.05)。结论:MCF-7他莫昔芬耐药细胞较MCF-7细胞而言,确实存在PI3K信号通路的过表达,这与文献报道相符。三黄煎剂能够抑制MCF-7他莫昔芬耐药细胞增殖、迁移、侵袭以及血管新生的能力,并且其明确的一个作用靶点是PI3K信号通路。