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研究背景：关节软骨损伤是临床常见的骨科疾病,由于关节软骨本身缺乏修复机制,在损伤后难以恢复原有的组织机构,因此在治疗上有较大的困难。近几年软骨组织细胞工程技术发展迅速,被认为将能给关节软骨损伤的治疗带来突破。骨髓间充质干细胞是一类可进行自我复制和更新的细胞,在不同的理化环境和细胞因子的诱导下能够跨胚层向骨、软骨、脂肪、神经、肌肉等多种谱系分化。因为这一特性,骨髓间充质干细胞在软骨组织细胞工程技术中担当重要角色,用作种子细胞,但目还前存在两方面的问题：(1)将骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞的效率有待提高；(2)形成的软骨细胞容易老化。微囊泡(Microvesicle,MV)是由一层界膜和内含物组成的微小囊泡,它是细胞在受到刺激或者凋亡的过程中,由细胞质膜直接向外形成小的突起,进而形成芽泡并最终从细胞质膜上脱落形成的。细胞在形成MV的过程中会选择性地将生物活性分子如蛋白质、脂质、mRNA及miRNA等包裹到MV囊腔中或置于膜表面,从而介导细胞之间的信息传递。已有研究发现,MV不仅可以促进靶细胞增生分化,而且携带抗凋亡因子,可以抑制细胞凋亡。研究目的受此启发,本研究将利用诱导多潜能干细胞技术,将软骨细胞反向诱导转化为多潜能干细胞(iPSCs),再刺激使其产生MV,探讨这种MV对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化及增殖的影响,并进一步明确其作用机理,为MV用于软骨损伤修复提供有力的依据。研究方法1、使用胰酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及贴壁培养法,从4月龄新西兰大白兔的关节软骨中提取软骨细胞,构建兔软骨细胞系。2、采用慢病毒基因投递法将4种转录因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)导入体外培养的兔软骨细胞中,将其重编程为iPSCs。通过荧光显微镜观察其形态变化和绿色荧光表达情况；通过RT-PCR的方法检测其标志性基因Oct4、 Sox2、c-Myc、Klf4、Nanag的表达；通过免疫荧光检测标志性蛋白Oct4、Sox2、Nanag、SSEA-3、SSEA-4、TRA、TRA-1-60、TRA-1-81的表达。3、采用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合,分离、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行体外培养扩增。流式细胞仪进行分析、鉴定,用倒置显微镜观察细胞的生长情况,绘制P3、P5代细胞生长曲线。4、条件培养刺激iPSCs分泌MV,并采用经典的方法进行收集。Zeta电位仪分析MV的粒径分布,与文献报道进行比对。对MV进行PKH26染色,观察兔BMSCs对MV的内化。5、MV与兔BMSCs共同培养,观察BMSCs细胞形态变化,通过检测CollagenⅡ和Sox9基因表达判断BMSCs成软分化可能性。对BMSCs进行三维培养,检测不同诱导条件下BMSCs向软骨转化的能力。6、检验MV对BMSCs增殖作用的影响：(1)MV与BMSCs共育后,采用CCK-8法测量其生长曲线,比较不同培养条件下BMSCs的增殖活性。(2)检验MV对BMSCs抗凋亡作用的影响,氧化应激诱导不同培养条件下的BMSCs,检测各组细胞中caspase-3的活性。经氧化应激诱导后的BMSCs继续进行三维培养21天,Tunel法检测BMSCs成软骨转化后的细胞凋亡率。根据caspase-3被激活的程度和细胞凋亡率来判断MV对BMSCs向软骨软化增殖的影响。7、根据MV对BMSCs增殖分化的影响,判断其可能含有的mRNA,并采用RT-PCR进行验证。将MVs经过RNase预处理后,再与BMSCs作用,与未经RNase处理组对比,判段MVs是否是通过传递母细胞特定的mRNA,来影响BMSCs的增殖与分化的。研究结果1、利用胰酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及贴壁培养法,可以成功分离得到兔软骨细胞,所构建的兔软骨细胞系可以满足后续的实验要求。2、兔软骨细胞被病毒感染后第4天,可见到类似ESC克隆出现,第20天克隆足够大可以挑克隆以扩大培养,预示着软骨细胞已开始重编程。iPSCs生物学特性鉴定结果发现：第9天可见到有绿色荧光的iPSC克隆出现,AKP染色呈强阳性；表达ES细胞特有的标志性基因。3、密度梯度离心法与贴壁培养法相结合可以分离得到高纯度的兔骨髓间充质干细胞,生长动力学分析结果表明P3-P5代细胞增殖能力强,生长旺盛,可用于下一步的研究工作。4, iPCs在特定条件下可以大量分泌MV,Zeta电位检测结果表明我们得到的MV粒径与文献报道一致。PKH26标记的MV与BMSCs孵育,2h后可以在BMSCs细胞检测到红色荧光信号。14小时后几乎每个BMSCs都显示红色荧光。这表明,IPSCs分泌的MV能容易地被BMSCs吸收。5、MV与兔BMSCs共同培养后,BMSCs的形态逐渐由(形)向软骨细胞的(形)变化。Q-PCR结果表明,在相同的培养条件下MV处理组中Collagen Ⅱ和Sox9基因表达量显著高于MV未处理组,说明MV的存在,可以大大增强BMSCs向软骨分化能力。BMSCs三维培养21天后的成软骨检测同样印证了这一结论。6、MV的存在可以明显提高BMSCs的增殖活性。在相同的培养条件下MV处理组中的BMSCs经氧化应激诱导后,活化的caspase-3表达量显著低于MV未处理组。培养环境为正常培养液还是常规诱导液,对BMSCs抗凋亡能力的影响不大。经氧化应激诱导后的BMSCs继续进行三维培养21天,MV处理组的细胞凋亡率明显高于MV未处理组,而培养环境为正常培养液还是常规诱导液,对其没有明显的影响。由此判断MV对BMSCs增殖有很好的促进作用。7、RT-PCR检测结果表明MV含有SOX9、TGF-β1、FGF、BMP、IGF-1、Bcl-2的mRNA,这些mRNA介导了BMSCs向软骨转化,并使其具有很好的抗凋亡能力。将MV经RNAase处理后,将不具备这样的能力。结论：通过慢病毒基因投递法可以将软骨细胞重编程为iPSCs,在一定条件下,iPSCs可以分泌大量MVs,所产生的MVs不但可以诱导BMSCs细胞向软骨分化,而且可以增强其抗凋亡的能力,延缓诱导生成软骨细胞的老化。检测MVs成分发现,含有可以调控BMSCs转化和凋亡的SOX9、TGF-β1、FGF、BMP、IGF-1、Bcl-2的mRNA, BMSCs通过内化MVs,将这些功能的mRNA转入细胞内,对自身的转化与增殖进行调控。软骨细胞重编成iPSCs后,不仅具有干细胞特性,还保留了原软骨细胞的某些特性,可以通过分泌MV的方式,将这些信息传递给BMSCs,从而有效促进BMSCs向软骨细胞分化,本研究结果将为软骨-iPCs来源的MV用于软骨损伤修复提供可靠的依据。