第一部分 rMSCs生物学特性的研究 骨髓中含有两大类细胞群，一个是能产生红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，它为循环血液提供前体细胞(或称为祖细胞)，这是人所共知的。另一个就是同样符合干细胞定义的非造血性干细胞。这种干细胞样的细胞被称为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)或间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。20世纪70年代中期，Friedenstein的先驱性研究揭示了骨髓中存在非造血干细胞这一事实，其后的二十年来，虽然对MSCs多向分化能力的特性了解不断加深，但仍然有不少疑问有待进一步研究。我们对MSCs的分离，培养条件下的生长特性及表面抗原标志进行了观察研究。 利用MSCs具有贴壁生长的特性，分离MSCs。光学及电子显微镜下观察细胞形态。MTT法，测定MSCs生长曲线。以16／cm~2和3／cm~2两种不同的细胞接种密度，并添加EGF，bFGF，EGF+bFGF，生长18天后，记数生成的细胞克隆及细胞数。流式 天津医科大学博士学位论文细胞仪检测MSCs免疫细胞表型。 全骨髓细胞接种后，通过更换培养液，弃去悬浮生长的造血细胞，ro一14天后，MSCs形态上趋于一致，光镜下呈梭形或纺睡形的成纤维样细胞。以3个细胞/c扩、16个细胞/c mZ不同的细胞密度接种于75c扩底面积培养瓶，培养18天后，3个细胞/c扩和16个细脚cmz组，在Q一MEM中，按照接种单位细胞产量(/ Icell)生成的细胞数分别为:56.89士8.55，22.5士2.64; 克隆数(八OOeells)分别为1 .69士0.37，0.60士0.11。3个细胞/c扩，明显多于16个细脚cmZ组，统计学分析表明差异有显著性，表明接种密度对MSCs的影响。EGF、EGF+bFGF对细胞增殖有显著的促进作用。流式细胞仪免疫细胞表型检测表明MSCs 83.1%表达CD90，80%表达CD71;只有3.53%表达CD45;3.51%表达CD 14;3.71%表达 CD34;4.67%表达HLA一DR。 MSCs可以通过其贴壁的特性加以分离，MSCs能较长时间传代培养并且其形态不发生明显改变，从形态学上尚不能鉴别MSCs，免疫细胞表型测定有助于识别MSCs。低密度接种培养可获得较多的细胞量，EGF能刺激MSCs快速增殖。第二部分rMSCs体外诱导分化为神经元样细胞骨髓中的HSCs能持续补充循环血细胞;MSCs通常只产生间 天津医科大学博士学位论文叶源的细胞。发育过程实际上是细胞命运的进行性限制过程:早期胚胎细胞是全能的，而出生后动物的成体干细胞，即组织特异性干细胞，据认为只能分化为它们所存在组织中的细胞类型。MSCs是经典的内胚层细胞，它代表了一个独特的细胞群，尽管不是全能的，但它们可以自我更新，并分化为不止一种特异的细胞类型。在体内、体外可以分化为传统上认为属于外胚层的细胞如神经元，胶质细胞。这些研究动摇了发育生物学的经典理论，这意味着这些细胞可以再程序化而转分化(transdifferentiated)为其它胚层的细胞。我们研究MSCs在体外培养中，在多种诱导因子的作用下，MSCs向神经细胞分化的能力。 对MSCs3~4代培养细胞分别以3种神经诱导培养液诱导，光学显微镜下观察细胞形态变化，诱导培养6天后，细胞进行神经元特异抗体免疫组化染色鉴定，了解细胞分化的情况，记数MSCs分化为神经元的比率。 细胞在诱导后30科O分钟即开始出现变化，细胞体收缩，细胞从梭形变为圆形，细胞折光性增强，并有突起形成，细胞有单极，双极及多极神经元样细胞出现。随时间增加，神经元样细胞的突起可连成网状。对用诱导培养液3诱导6天的细胞进行免疫组化染色，神经元样细胞表达NSE，NeuN，及MAP一2，表明其有神经元蛋白表达，NSE、MAP一2，NeuN的表达率分别为59.83%， 天津医科大学博士学位论文45.17%和50.83%。 MSCs在神经诱导培养液中能很快分化成神经元样的细胞，免疫组化染色这些细胞表达神经元特异性蛋白，这种由细胞外信号触发的分化是快速的，说明MSCs本身具有神经元的基因表达序列，MSCs是多能的，具有向神经外胚层分化的能力。 第三部分rMSCs静脉移植治疗大鼠脑损伤 进行神经移植的主要障碍在于有限的供体组织。异体胚胎，胎)匕神经干细胞是一个理想的移植组织，但采集细胞及移植时间窗较短，伦理及法律原因也阻碍了胚胎组织用来进行广泛的神经移植。MSCs是一个潜在的能应用于移植，并能诱导内源性干细胞增殖的细胞。使用自体的MSCs进行移植，避免了外源物质的进入，也避免了伦理学，法律方面的障碍，并可显著减少免疫抑制剂的应用。我们将大鼠MSCs经尾静脉注射移植入脑创伤大鼠，了解骨髓源性细胞在脑内的迁移情况，以及对大鼠神经运动功能的影响。 以自由落体打击法制作诚star大鼠脑损伤模型，分4组，将BrdU标记MSCs，以3 x 106细胞/ml，在大鼠伤后l天(第1组，n=6)，3天(第2组，n=Io)，7天(第3组，n=7)及未损伤大鼠 (第4组，对照组，n=3)，l血经尾静脉注射入大?