活性硫烷硫（reactive sulfane sulfur,RSS）是指含硫化合物中至少含有两个以共价键相连的硫原子,且其中一个硫原子呈0价的化合物。活性硫烷硫以十分多样的形式存在于环境中及生物体内,大体可分为无机的活性硫烷硫和有机的活性硫烷硫两大类。这些化合物一般呈链式结构,其中所包含的0价硫同时具有亲电性和亲核性,这种结构特性使活性硫烷硫能够参与多种反应,包括形成黄铁矿、调节Ca2+的代谢以及参与蛋白质的过硫化修饰等等。近年来,随着研究的不断深入,活性硫烷硫被发现在许多生命进程中都发挥着十分重要的作用,例如参与炎症反应,心脏保护,神经系统调节,细胞内抗氧化,线粒体功能和能量代谢,维持胞内氧化还原稳态等等,也有观点认为在胞内发挥信号传递作用的直接载体是活性硫烷硫而非硫化氢（H2S）。这些都说明活性硫烷硫在胞内扮演着至关重要的角色,我们需要进一步研究活性硫烷硫在胞内的分布、动态变化以及发挥作用的机制。然而目前,我们仍缺乏一种可靠的手段来实现这一研究目的。为了解决上述问题,我们基于红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）mCherry 和远红荧光蛋白（far-red fluorescent protein,FRFP）mKellyl 分别构建了能够实时监测亚细胞器内活性硫烷硫水平的荧光探针。构建的方法是在RFP的氨基酸序列上选择两个靠近发光基团的氨基酸残基突变为半胱氨酸残基,在设计突变时控制两个半胱氨酸残基之间能够形成的化学键的键长,使其可以与活性硫烷硫反应形成多硫键且不能与ROS反应形成二硫键。形成的多硫键位于RFP发光基团的附近,会使其三维构象发生变化,从而使荧光光谱特性产生相应的改变。通过检测荧光光谱的变化,就可以相应的反映活性硫烷硫的变化趋势。本文中,我们分别构建了三种不同的荧光探针。一是基于mCherry构建了一个对活性硫烷硫敏感的红色比率荧光探针psRFP（polysulfides-sensitive red fluorescent protein）。该探针由466 nm/610 nm的荧光比值来反映活性硫烷硫的变化趋势,有效避免了绿色荧光的干扰。我们成功将该探针应用于对大肠杆菌胞质内以及酿酒酵母胞质和线粒体内活性硫烷硫水平的实时监测以及不同环境条件下变化趋势的分析。并且我们还尝试将该探针应用于高等动物细胞中,如FHC、HCT116细胞系。二是基于mKellyl构建了一个对活性硫烷硫敏感的远红荧光探针 psFRFP（polysulfides-sensitive far-red fluorescent protein）。经过改造后的mKelly1其发射光位于630 nm处,处于远红区,这比起红光更适合应用于胞内。我们成功将该探针分别应用于大肠杆菌胞质内以及酿酒酵母胞质内。三是我们在二的基础上将GFP与二中构建的探针融合,得到GFP-psFRFP融合蛋白。通过检测该探针512 nm/630 nm的荧光比值我们可以对活性硫烷硫进行定量检测,其中GFP的作用是标定蛋白的表达量。我们测定了该融合探针对HSnH的标准曲线,并检测了酿酒酵母胞质内活性硫烷硫的含量随其生长周期的变化情况。我们的探针与已报道的方法相比具有明显的几点优势。首先可以对活细胞内活性硫烷硫水平进行实时、动态的监测,其次可以用于对细胞内不同亚细胞器区域的定位检测,再次有效避免了生物来源的绿色荧光的干扰,最后探针经过我们的进一步改造能够实现对活性硫烷硫的定量检测。综上所述,本文首次基于红色荧光蛋白构建了三种能够专一地响应活性硫烷硫的荧光探针,针对不同的实验需求,我们的探针可以对活细胞内的活性硫烷硫进行实时的动态监测,也可以定位到亚细胞器中对某个细胞区域进行针对性的检测,还可以定量检测活性硫烷硫。本文利用构建的探针,研究了大肠杆菌以及酿酒酵母细胞在生长的不同时期以及不同的环境压力下胞质内或亚细胞器内活性硫烷硫水平的变化情况,并且尝试将psRFP应用于人类细胞株中。我们的探针极大地丰富了研究活细胞内活性硫烷硫的手段,为活性硫烷硫在活细胞内的原位检测提供了可能性,为活性硫烷硫对生物的生理功能以及作用机制的研究提供了新的研究思路。