传统观念认为,哺乳动物中枢神经系统中的神经元属于有丝分裂后细胞,不具有分裂增殖能力。但是,成熟神经元脱离细胞周期的分子机制目前还不清楚,而神经元能否重回细胞周期一直是神经科学领域备受关注的重大科学问题。在实验室前期研究工作中,我们发现N4可以下调原代皮层神经元中Necdin的表达并诱导神经元分裂。文献报道N4的主要成分之一,3,5,3’-三碘甲状腺原氨酸(T3)可以在分化的P19细胞中下调Necdin的表达。因此,本课题以原代培养的皮层神经元为研究对象,继续探讨下调Necdin对有丝分裂后神经元的影响。第一章：大鼠皮层神经元的分离培养及鉴定原代培养的神经元细胞是神经科学领域重要的研究工具。在本章中,我们取材于E14-16d的Wistar胎鼠进行皮层神经元的原代培养。为了确保神经元的纯度,尽可能的消除非神经元细胞对实验的干扰,我们在进行无血清培养的同时向原代培养物中加入1.5μg/ml Ara-C,作用48h后再通过换全液去除其作用,以避免残留的Ara-C影响后续实验。同时,考虑到胶质细胞分泌的细胞因子缺失对神经元的影响,以及Ara-C本身对神经元的毒性作用,我们使用了来源于胶质细胞的条件培养液,使原代培养的皮层神经元处于相对较好的生存状态。体外培养5d后我们通过免疫细胞化学标记及流式细胞分析对神经元进行纯度鉴定。免疫细胞化学染色结果显示,原代培养物中绝大多数细胞为呈现MAP2阳性的神经元细胞,可观察到少量GFAP阳性细胞,提示存在少量的星形胶质细胞,而未见明确的Nestin阳性细胞,说明原代培养物中没有神经干细胞及前体细胞。流式细胞分析结果显示,培养物中神经元纯度接近100%,可用于下一步实验研究。第二章：慢病毒干涉下调Necdin对神经元细胞周期的影响实验室前期研究工作中我们发现了可能与神经元脱离细胞周期并维持其分裂静止状态密切相关的分子Nedcin,并证实该分子很可能在N4诱导神经元进入细胞周期的过程中发挥重要作用。在本章中,我们将借助necdin干涉慢病毒进一步验证Necdin与神经元细胞周期的相关性。首先,我们以ShcC为神经元标志物,通过免疫荧光标记的方法检测了necdin干涉慢病毒与对照慢病毒的感染效率,结果显示病毒感染4d后原代培养物中分别有79.81%和81.85%的神经元细胞被对照慢病毒及干涉慢病毒感染。其次,我们通过Real-time PCR及、Vestern Blot方法检测了干涉慢病毒对Necdin表达情况的影响。结果显示,与对照慢病毒相比,干涉慢病毒可以显著下调原代神经元中Necdin mRNA及蛋白表达水平,显示出良好的干涉效果。最后,我们以ShcC为神经元标志物进行免疫荧光标记,检测necdin干涉慢病毒对神经元细胞周期的影响。病毒感染4d后我们在原代培养物中捕捉到了处于有丝分裂不同时相的神经元细胞,提示下调Necdin可以诱导神经元重回细胞周期。上述结果与实验室前期研究中N4可以下调Necdin表达并诱导神经元进入细胞周期的现象具有较好的一致性,也进一步证实了神经元进入细胞周期与Necdin表达下调有关。第三章：T3对原代神经元的影响在本章中,我们分别检测了T3对原代神经元中Necdin表达,E2F1亚细胞定位,神经元细胞周期,存活率及凋亡情况的影响。在第一节中,我们通过RT-PCR及Western Blot方法检测了T3对原代神经元中Necdin表达情况的影响,结果显示与未经诱导的神经元相比,T3诱导后24h至48h Necdin mRNA及蛋白表达水平出现持续下调。在第二节中,我们通过Western Blot及免疫荧光双标记的方法检测了T3对原代神经元中E2F1表达和亚细胞定位的影响。结果显示T3并不影响原代神经元中E2F1的表达水平,但是可以诱导E2F1入核。在第三节中,我们通过免疫荧光标记,流式细胞分析及Western Blot方法检测了T3对原代神经元细胞周期的影响。免疫荧光标记结果显示T3可以诱导神经元分裂,但流式细胞分析结果表明T3作用后神经元细胞周期并未发生明显改变,随后的Western Blot检测结果也显示T3不影响神经元中细胞周期蛋白的表达水平。流式细胞分析及Western Blot检测呈现阴性结果很可能是由于原代培养物中诱导分裂的神经元数量较少,而这两种检测手段灵敏度有限,并且,原代培养物中存在的少量可分裂细胞也对实验造成了一定十扰。在第四节中,我们通过CCK-8法检测了T3对原代神经元存活率的影响,结果表明T3作用24h及48h后神经元存活率均显著下降。在第五节中,我们通过TUNEL染色,Annexin V/PI双染及Western Blot等方法检测了T3对原代神经元凋亡情况的影响。实验结果表明,T3可以诱导原代神经元中Caspase3的活化,TUNEL染色及Annexin V/PI双染实验结果也显示T3可以导致神经元凋亡。在第六节中,我们通过Real-time PCR及Western Blot方法检测了T3对原代神经元中P53表达,活化,及其下游凋亡相关分子Bax及Bcl-2表达情况的影响。结果显示,T3并未影响P53的表达及活化,也没有引起Bax及Bcl-2的表达变化。这说明T3很可能通过非P53依赖的途径诱导神经元凋亡。综上所述,本研究以原代培养的大鼠皮层神经元为研究对象,一方面验证了慢病毒干涉下调Necdin可以诱导神经元重回细胞周期；另一方面,T3可以下调原代神经元中Necdin的表达水平,促进E2F1入核,诱导神经元分裂,并且很可能引起非P53依赖性的细胞凋亡。