瘤胃的发酵使得反刍动物产生了过多的热量,外界环境温度湿度的升高,伴随着干物质采食量的急剧下降,这一切对原产于寒冷北欧的荷斯坦奶牛构成了严重的应激。本课题以二氢吡啶为试验材料,以荷斯坦奶牛为对象,研究了不同应激水平下添加二氢吡啶对奶牛机体抗氧化状态、瘤胃发酵和瘤胃细菌区系的影响。试验共分为4个部分。1不同应激水平下添加二氢吡啶对奶牛机体应激状态的影响采用温湿指数(THI72)法同时结合奶牛血清、瘤胃液中代谢产物及酶类的水平来评定奶牛机体的抗氧化状态。本研究分为4个时期：无应激且不添加二氢吡啶(NS-ND)、无应激添加二氢吡啶(NS-D)、应激但不添加二氢吡啶(S-ND)、应激且添加二氢吡啶(S-D),二氢吡啶添加量为每头牛3.0g/d(即0.6mg/kg体重)。结果显示：试验期间春季奶牛舍内温度范围为6.5℃-24.0℃,湿度为51-95%,THI为49.24-69.76；夏季奶牛舍内温度范围为25.5℃-37.0℃,湿度为30-95%,THI为76.96-90.28。即在整个试验期内外界温热环境对奶牛构成的应激状况完全符合试验的要求。与春季相比在夏季热应激时期,奶牛血清中的超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC)极显著下降(P<0.01),血清过氧化物酶(CAT)的活力显著下降,且血清丙二醛(MDA)的含量显著升高(P<0.01)。在添加二氢吡啶后无论春季还是夏季,SOD的活性均有大幅提升；全期试验以NS-D时期的水平最高,为90.17U/mL,分别比NS-ND、S-ND、S-D时期高出6.50U/mL、37.6U/mL、18.48U/mL。总抗氧化能力仅有增加的趋势,差异不显著。MDA的含量在添加二氢吡啶后有所下降,但差异不显著(P=0.14)。瘤胃内各抗氧化指标的变化趋势类似于血清中的变化。以上试验结果表明：随着应激水平升高,奶牛机体和瘤胃内的抗氧化能力下降,在添加二氢吡啶后可得到明显改善,SOD、GSH-Px和CAT酶活力升高,T-AOC能力提高,MDA含量下降,并且瘤胃内的各项指标更敏感。2不同应激水平下添加二氢吡啶对奶牛瘤胃发酵的影响本试验分别测定了四个时期瘤胃内的各项发酵指标。结果显示：应激和添加二氢吡啶均显著降低瘤胃液的pH值(P<0.05),但pH值均处于正常的范围内。S-ND时期与NS-ND时期相比,瘤胃液中NH3-N浓度呈升高的趋势,且差异极显著(P<0.01)。应激和无应激时期添加二氢吡啶后,NH3-N浓度均显著降低(P<0.01),下降幅度分别为29.8%和29.4%。瘤胃液内挥发性脂肪酸(VFA)的浓度随应激水平的增加,显著下降(P<0.01),下降幅度为25.0%。添加二氢吡啶可以显著提高了VFA的浓度,在春季和夏季均达到显著水平(P<0.01),分别提高31.0%和12.2%。随应激水平的升高,瘤胃液中乙酸的百分比含量下降,丙酸和丁酸的百分比含量升高,但差异不显著(P>0.05)。乙丙比在应激增加时,呈稍下降趋势,差异不显著(P=0.13)；在添加二氢吡啶后,无论春季和夏季均显著增高(P<0.01)。以上试验结果表明：热应激会降低瘤胃pH值,升高NH3-N的含量,降低VFA的产量,降低乙酸的百分比含量,提高丙酸和丁酸的百分比含量,降低乙丙比,使瘤胃趋向于丙酸发酵模式；添加二氢吡啶可以降低pH值和促进瘤胃对NH3-N的吸收,提高VFA的产量,改善乙丙比,从而影响瘤胃的发酵模式。3不同应激水平下添加二氢吡啶对奶牛瘤胃微生物菌群数量的影响本研究采用Real-Time PCR技术测定了真菌(Fungi),原虫(Protozoa)、产甲烷菌(Methanogens)、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)、蛋白溶解梭菌(C.proteoclasticum)、琥珀酸拟杆菌(F.succinogenes)、白色瘤胃球菌(R.albus)和黄色瘤胃球菌(R.flavefaciens)相对于瘤胃总细菌(Total bacteria) 16S rDNA的量。结果显示：溶纤维丁酸弧菌(B.fibrisolvens)相对于总细菌16S rDNA的数量,夏季热应激时期较春季显著下降(P<0.01)；添加二氢吡啶后数量增加且达到显著水平(P<0.01),并且应激和添加二氢吡啶之间存在互作效应(P<0.01)。蛋白溶解梭菌(C.proteoclasticum)相对于总细菌16S rDNA的数量,夏季的仅为春季的17.0%,下降明显达到显著水平(P<0.01)；S-D相对于S-ND时期数量增加但差异不显著。产甲烷菌(Methanogens)相对于总细菌16S rDNA的数量,夏季为春季的67.8%,呈下降趋势且差异显著(P<0.01),添加二氢吡啶后,甲烷菌数量呈减少趋势,且差异显著(P<0.05)。原虫(Protozoa)相对于总细菌16S rDNA的数量,其变化趋势与溶纤维丁酸弧菌基本类似,应激增加时,数量下降且差异极显著(P<0.01),添加二氢吡啶后数量有所上升,但是应激与二氢吡啶之间不存在交互作用。白色瘤胃球菌(R.albus)相对于总细菌16S rDNA的数量,夏季相对于春季的数量,显著下降(P<0.01),但是无论外界环境有无应激添加二氢吡啶对其数量均无显著影响(P=0.83)。黄色瘤胃球菌(R.flavefaciens)相对于总细菌16S rDNA的数量,热应激时期,其数量呈增加的趋势,但差异不显著,添加二氢吡啶后,春季对其数量无显著影响,夏季呈增加的趋势。产琥珀酸丁酸弧菌(F.succinogenes)相对于总细菌16S rDNA的数量,外界应激增强时,数量下降差异极显著(P<0.01),添加二氢吡啶后,其数量增加,仅在春季呈现差异显著,夏季差异不显著,应激和二氢吡啶对产琥珀酸丁酸弧菌的数量的影响存在一定的交互作用(P=0.03)。真菌(Fungi)相对于总细菌16S rDNA的数量,其变化趋势和产琥珀酸丁酸弧菌相似,添加二氢吡啶后仅在春季呈差异显著,且应激和二氢吡啶存在交互作用(P<0.05)。以上试验结果表明：应激水平的增加会抑制瘤胃微生物的生长,二氢吡啶的添加对瘤胃内的纤维分解菌和氢化相关菌的生长起到了促进的作用,同时对产甲烷菌有一定的抑制效果。4采用PCR-DGGE技术研究不同应激水平下添加二氢吡啶对奶牛瘤胃细菌区系的组成和动态变化的影响本研究利用基于16S rDNA基因的PCR-DGGE技术研究了不同应激水平下添加二氢吡啶对奶牛瘤胃细菌区系的组成和动态变化的影响。结果显示：随应激水平的增加,DGGE图谱上的条带数减少,细菌多样性指数下降。添加二氢吡啶后,原有的一些条带亮度增强,且出现了新的条带。图谱相似性分析的结果表明,12个瘤胃液样品的DGGE图谱可以分为明显的两个簇,热应激时期的8、9号样品单独形成一簇,其余的形成了另一簇,两簇之间的相似性仅为42%,这表明热应激时的瘤胃细菌区系发生了剧烈的变化。基因序列分析结果表明,DGGE图谱中优势条带的16SrDNA基因序列中有8个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于99%,另一条未知菌种的序列相似性也大于99%。大部分的16S rDNA序列归为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。DGGE图谱中存在差异的条带分别为B3毛螺菌属(Lachnospira),多出现在未添加二氢吡啶时期；条带B7黄单胞菌属(Xanthomonadaceae)的Lysobacter,条带B39黄单胞菌属(Xanthomonas),多出现在添加二氢吡啶时期。在所有样品中均存在的为条带12不动杆菌属(Acinetobacter);条带22假单胞菌属(Pseudomonas);条带26未知菌种。DGGE图谱显示,二氢吡啶可以选择性的促进瘤胃中变形菌门(Proteobacteria)中黄单胞菌属(Xanthomonadaceae)的Lysobacter和黄单胞菌属(Xanthomonas)的生长。以上试验结果表明：外界环境的应激和添加二氢吡啶对奶牛瘤胃细菌区系有一定的影响；且瘤胃液中的细菌主要归属于厚壁菌门和变形菌门。