本论文共分为四章内容。第一章文献研究第一节通过本草考证追溯桑叶作药用的历史渊源和古代主要应用方向;收集中国的桑属植物15个种与4个变种的生长地点及环境信息展示桑叶资源的分布情况;总结了桑树资源桑叶、桑枝、桑椹和桑白皮的药用功效及在产业中的应用现状和利用价值;总结了桑叶中主要化学成分及药理活性研究以及桑叶在中药复方中的应用情况,综合论述了桑叶药用资源的研究进展,为桑叶药用植物资源的深入研究与高效综合利用提供科学参考。第二节糖尿病发病机制主要包括胰岛素抵抗、葡萄糖的跨膜转运能力下降、葡萄糖受体功能异常及炎症因子的影响,糖尿病常见并发症包括糖尿病肾病、心脑血管疾病、糖尿病肝损伤、视网膜病变及神经病变等,西医对糖尿病常用治疗方法有促进胰岛素合成和分泌、提高胰岛素敏感度、使用胰岛素及其类似物和减慢碳水化合物吸收类药物的方法,中医理论治疗糖尿病常涉及单味中药、中药单体和中药复方制剂。本节通过总结糖尿病发病机制及治疗规律,以期为治疗糖尿病和应用中药改善糖尿病提供依据和参考。第二章桑叶有效组分的制备与成分分析第一节依据课题组前期研究方法,桑叶黄酮和酚酸类的制备为采用70%乙醇回流提取,经AB-8大孔树脂纯化获得;桑叶生物碱以水提醇沉法所得上清部分浓缩过阳离子交换树脂纯化获得;桑叶多糖采用水提醇沉方法获得的沉淀经AB-8大孔树脂纯化得到。第二节在课题组前期研究基础上,采用高效液相方法对纯化的桑叶黄酮及酚酸组分测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷6种成分的含量;采用苯酚-硫酸比色法测定桑叶多糖纯化物中中性多糖含量,检测波长为490 nm,硫酸-咔唑法测定其酸性多糖含量,检测波长为512 nm;采用液质联用技术对纯化的桑叶生物碱组分中的DNJ和Fagomine进行含量测定。黄酮和酚酸组分中各成分含量分别为3.85%、3.43%、4.3 8%、3.56%、1.58%、1.02%,总含量为17.82%;多糖组分中测得中性多糖和酸性多糖含量分别为18.03%、0.83%,总多糖含量为18.86%,桑叶生物碱中DNJ、Fagomine的含量分别为27.7%和3.78%,总生物碱含量为31.48%。几种方法均简单易操作,重复性、精密度、稳定性良好,为后续实验研究提供了基础。第三章桑叶多组分对db/db小鼠糖尿病及肝肾损伤的改善作用及机制研究第一节本节以db/db小鼠为实验动物模型,应用桑叶黄酮和酚酸组分、生物碱组分、多糖组分进行干预治疗,对其各项生化指标检测,对肝脏和肾脏病理切片进行分析,以及利用Western blot法分析肝脏组织胰岛素信号转导通路和肾脏TGF-β/smad信号通路。生化指标分析结果显示,空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、尿微量白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量及胰岛素抵抗指数在模型组中显著增加;肝肾病理切片也显示模型组发生明显的病理变化。给药干预后,桑叶多糖组和生物碱组的空腹血糖值和尿液中尿微量白蛋白含量明显下降,而桑叶黄酮和酚酸组与生物碱组对降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平有显著作用,与模型组相比,桑叶各治疗组的血脂水平降低,均趋向于正常组方向;各给药组的病理变化也得到改善。Western blot实验结果显示,肝脏组织中InsRβ与PI3K蛋白的水平显著降低,IRS-1和NF-κB蛋白的表达增加,提示db/db小鼠发生胰岛素抵抗和炎症反应,导致胰岛素受体传导通路紊乱,经过药物调节的各组均有不同程度的回调,生物碱组和多糖组效果较为明显,但各给药组对IRS-1蛋白无明显调节作用;肾脏中TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3和Smad4蛋白水平显著升高,推测TGF-β1信号通路被激活且发生了肾纤维化,黄酮和酚酸组与多糖组对上述蛋白表达回调的效果尤其明显,优于生物碱组。第二节采用UPLC/QTOF-MS联用技术,分析小鼠血清内源性代谢物的变化,结合前面所述对药效的评价,探讨桑叶中三个有效组分治疗糖尿病及并发症的效应及作用机制。通过代谢组学分析,在血清中鉴定出13种内源性潜在生物标志物,包括PGH3、溶血磷脂酞胆碱、磷脂酞胆碱、棕榈酸、顺乌头酸等与糖尿病相关的生物标志物,其代谢途径涉及醚脂类代谢、二羧酸代谢和花生四烯酸代谢。桑叶有效组分干预后可与模型组明显区分,且向正常组靠拢,较阳性药二甲双胍的效果明显,其中黄酮和酚酸组与生物碱组表现出较好的改善效果,提示桑叶有效组分的多效应多靶点作用方式不同于传统降糖药,为进一步揭示桑叶多组分的作用机理及特色优势提供了科学依据。第三节以自发性肥胖的糖尿病模型db/db小鼠为研究对象,在药效评价的基础上,通过16S rDNA测序的方法研究桑叶黄酮和酚酸、多糖、生物碱组分对糖尿病小鼠的生物效应及其对肠道菌群的调节作用,以从肠道微环境的角度探讨桑叶多组分干预糖尿病的作用机制。结果表明,与正常组相比,db/db小鼠肠道内菌群从门水平到属水平均发生了显著变化,包括5个门和10个属;且模型组小鼠肠道菌中厚壁菌门、变形菌门等比例显著降低,拟杆菌的比例升高;给药后拟杆菌、厚壁菌门中的毛螺菌科、罗斯氏菌属以及脱硫杆菌属等均得到有效调节,尤其是生物碱组调节作用最为显著。肠道菌群功能预测显示,膜转运,碳水化合物代谢,氨基酸代谢,能量代谢,核苷酸代谢,细胞过程与信号传递,脂质代谢,糖生物合成与代谢通路发生异常,说明db/db小鼠肠道内环境失去平衡导致了体内上述相关通路紊乱,从而又直接或间接的促进糖尿病的发展,提示桑叶有效组分具有通过缓解db/db小鼠肠道菌群失调的作用以改善糖尿病的作用。第四章基于细胞模型的桑叶多组分生物效应与机制探讨第一节应用细胞生物学方法,体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),探讨桑叶有效组分对高糖损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及机制。以含有浓度为40 mg·ml-1葡萄糖的培养基建立高糖损伤模型,分别给予不同剂量的桑叶黄酮和酚酸组分、桑叶多糖组分、芦丁、绿原酸、异槲皮苷,阳性药为氨基胍,MTT法观察细胞活力,检测细胞上清中内皮素-1、血管细胞粘附分子-1、丙二醛含量,Western blot法检测磷酸化p38、Erk1/2、c-jun、AKT的表达。与空白组相比,模型组细胞损伤率在50%左右,内皮素-1、血管细胞粘附分子-1、丙二醛含量升高,p38、Erk1/2、c-jun的表达增加,AKT的表达减少。桑叶有效组分干预后,各组细胞存活率均显著增加,且呈现浓度相关性,对细胞上清中各因子及细胞中各蛋白的表达也具有明显的调节作用,可见桑叶对高糖损伤HUVEC的保护作用与调节氧化应激、炎症反应,抑制细胞间黏附因子表达有关,为揭示桑叶治疗糖尿病微血管病变的机制研究提供了参考。第二节选取人肝癌HepG2细胞,以胰岛素体外诱导的方法建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型,探讨叶黄酮和酚酸组分与生物碱组分对HepG2细胞胰岛素抵抗的保护作用及协同作用机制。先后进行黄酮和酚酸组分与生物碱组分配比、绿原酸与DNJ配比研究,比例设置为1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、10:1,结果显示提取物与单体筛选出的最佳比例相同,均为接近自然比例的5:1组。对筛选出的比例进行量效关系研究,并采用等效线法、等辐射分析法共同评价桑叶黄酮和酚酸组分、生物碱组分及其配伍组合对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用,结果显示二者配比对胰岛素抵抗具有协同增效的作用。测定细胞中己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、甘油三酯(TG)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂蛋白脂肪酶(LPL)和固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP-1C)含量,模型组细胞相比于空白组HK、PK、LPL明显降低,G-6-P、TG、ACC和SREBP-1C明显增加。给予药物干涉后,各组细胞中的相关因子表达情况向空白组趋近,且成浓度相关性,并且从整体上看,从对于HK、G-6-P的调节来说,DNJ的效果更明显;对ACC、SREBP-1C的调节,绿原酸效果略优于DNJ;而二者配比后对其表达的调节优于单独使用的效果。推测黄酮对胰岛素抵抗的改善侧重于通过对肝脏脂代谢的调节以发挥作用,而生物碱偏向于对与糖代谢相关的异常的调节以产生效果。