1研究背景随着交通运输业的发展,骨折成为临床上的常见病和多发病之一。该病的特点为“年轻化、复杂化、高度致残化”。骨折已严重的影响着人类的生活质量、威胁着人类的健康,因而骨折的修复与愈合一直是骨科界研究的热点问题。在促进骨折愈合治疗上,中医药治疗历史悠久,疗效确切。中医学理论的精髓在于辩证论治,因此中医治疗根据骨折后症候学特点将骨折分为三期:早期活血化瘀、行气止痛;中期接骨续筋、舒筋活络;后期补益肝肾、强筋壮骨。该治则即为中医治疗骨折的指导原则。中医骨折三期治则对于骨折的治疗乃至中医骨科的发展起到了不可估量的作用。目前,中医骨折三期治则已成为现代中医药治疗骨折的指导原则,然而对于骨折三期治则的分子生物学机制研究则很少。中医骨折三期治则仅是基于对前人经验的总结,尚缺乏实验等方面的科学依据,随着现代分子生物学技术发展,研究骨折三期治则对骨折愈合的分子生物学机制,对指导骨折治疗,丰富骨伤科学内治法,具有重要意义。先期实验已经应用大鼠骨折模型进行蛋白质水平研究,并且初步证实了骨折分期治疗的必要性。从基因水平揭示骨折三期治则的作用机制未见报道。本次实验已经对骨生长因子VEGF和BMP-2,从X线评分、免疫组化、原位杂交等方面证实了骨折三期治疗效果优于其他治疗组。为进一步揭示中医骨折三期治则的分子生物学机制,应用原位杂交技术检测骨折愈合过程中FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA基因转录水平。研究其分布及表达规律及时间相,从现代医学的角度揭示中医骨折三期治则的科学性,指导骨折的临床治疗,推动中医骨科治疗的快速发展。2材料与方法2.1实验动物与骨折模型选用新西兰家兔,健康,雄性,体重2±0.5 kg;在桡骨中下段1/3处,造成3mm完全横断骨折。2.2随机分组将140只家兔随机分为四组,每组35只,分别为三期组（中药三期治疗组）、一期组（中药一期治疗组）、模型组（模型对照组）和阳性药组（阳性药物对照组）。三期组、一期组与阳性药组三组文中统称中药组。每个小组再随机分为7个小组,每组5只。2.3干预方法将中药制成含生药5g·ml^-1的浓缩口服液,灭菌后装瓶冷藏备用。分早晚2次,灌胃。根据量效反应确定实验最佳用药剂量为2倍等效剂量。根据骨折愈合分期方法与家兔骨折局部组织学变化,将家兔骨折愈合过程分为三期:早期即术后1-7天;中期即术后8-28天;后期即术后29-56天。三期组根据“中医骨折三期治疗”原则,分三期治疗:早期活血化瘀、行气止痛,选用加减肢伤一方;中期接骨续筋、舒筋活络,选用加减肢伤二方;后期补益肝肾、强筋壮骨,选用加减肢伤三方。一期组将骨折的早期、中期与后期合并为一期,活血化瘀、行气止痛、接骨续筋、补益肝肾、强筋壮骨,选用肢伤一方、二方与三方加减方。阳性药组全程给骨折挫伤胶囊水溶液。模型组给予和实验组等量的蒸馏水灌胃,每日2次。2.4标本处理术后第3、6、9、14、28、42、56天每组随机抽取一小组家兔用空气栓塞法处死,取左侧桡骨标本为观察对象,将标本固定、脱钙。2.5原位杂交检测骨折标本FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA。2.6图像及数据分析对骨折端骨干细胞、骨小梁、内骨膜、外骨膜、纤维骨痂组织各取两个高倍镜视野,对阳性表达细胞进行MOD值测定。用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析。3结果3.1模型组、一期组、阳性药组与三期组骨折愈合过程中FGF-2mRNA表达MOD值变化3.1.1各组骨干细胞FGF-2mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后14天:阳性药组显著高于模型组,p<0.05。术后42天:一期组显著高于模型组,p<0.05;三期组极显著高于模型组,p<0.01。术后56天:组间无差异。各组平均值比较显示:一期组极显著高于模型组,p<0.01;阳性组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组,p<0.01。三期组、一期组与阳性药组表达呈三峰曲线。中药组同时出现高峰,三期组峰值最高。模型组高峰出现晚峰值低。3.1.2各组骨小梁FGF-2mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后28天:阳性药组显著高于模型组,p<0.05;三期组极显著高于模型组,p<0.01。术后42天:一期组显著高于模型组,p<0.05;阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于一期组和阳性药组,p<0.01。术后56天:一期组显著高于模型组,p<0.05;三期组极显著高于模型组与阳性药组,p<0.01。各组平均值比较显示:一期组显著高于模型组,p<0.05;阳性药组显著高于模型组,p<0.05;三期组显著高于模型组、一期组、阳性药组,p<0.05。三期组高峰出现晚但峰值高。3.1.3各组内骨膜FGF-2mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后3天:三期组显著高于阳性药组,p<0.05。术后9天:一期组显著高于阳性药组,p<0.05;三期组极显著高于阳性药组,p<0.01。术后14天:阳性药组显著高于模型,p<0.05;三期组显著高于模型组,p<0.05。术后28天:阳性药组显著高于模型组与三期组,p<0.05。各组平均值比较显示:一期组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组、一期组与阳性药组,p<0.01。三期组、一期组在术后9天出现高峰。阳性药组成双峰曲线,在术后28天出现高峰。3.1.4各组外骨膜FGF-2mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后9天:三期组有高于模型组、一期组、阳性药组的趋势,p>0.05。术后56天:阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;阳性药组显著高于三期组,p<0.05。各组平均值比较显示:一期组极显著高于模型组,p<0.01;阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于阳性药组,p<0.01。三期组呈单峰曲线,术后9天出现最高峰。阳性药组呈三峰曲线,术后9天出现最高峰。一期组呈三峰曲线,术后28天出现最高峰。3.1.5各组纤维骨痂FGF-2mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后14天:一期组显著高于模型组,p<0.05;阳性药组极显著高于一期组,p<0.01;三期组极显著高于模型组,p<0.01。术后28天:三期组极显著高于模型组,p<0.01。各组平均值比较显示:一期组显著高于阳性药组,p<0.05;一期组极显著高于模型组,p<0.01;阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于阳性药组,p<0.01。3.2模型组、一期组、阳性药组与三期组骨折愈合过程中TGF-β₁mRNA表达MOD值变化3.2.1各组骨干细胞TGF-β₁mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后3天:阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组,p<0.01。术后6天:一期组显著高于模型组,p<0.05;三期组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于阳性药组,p<0.01。术后9天:三期组极显著高于模型组,p<0.01。术后14天:三期组极显著高于模型组,p<0.01。术后28天:一期组极显著高于模型组与阳性药组,p<0.01;三期组显著高于模型组,p<0.05。术后42天:三期组显著高于阳性药组,p<0.05。术后56天:组间无差异。各组平均值比较显示:一期组极显著高于模型组,p<0.01;阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组、一期组、阳性药组,p<0.01。三期组呈双峰曲线,三期组出现最高峰早,且峰值高。3.2.2各组骨小梁TGF-β₁mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后6天:组间无差异。术后9天:三期组显著高于模型组,p<0.05;阳性药组显著高于一期组,p<0.05;三期组极显著高于一期组,p<0.01。术后14天:一期组极显著高于模型组,p<0.01;一期组显著高于阳性药组,p<0.05;一期组、阳性药组、三期组均显著高于模型组,p<0.05。各组平均值比较显示:各组均显著高于模型组。三期组在9天出现高峰,峰值高。在术后14天,一期组出现高峰,三期组出现高峰早,持续时间长。3.2.3各组内骨膜TGF-β₁mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后9天:三期组显著高于模型组,p<0.05。术后14天:三期组极显著高于模型组,p<0.01。术后42天:阳性药组显著高于模型组、一期组,p<0.05;三期组显著高于模型组、一期组,p<0.05。3.2.4各组外骨膜TGF-β₁mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后3-14天:三期组有高于模型组、一期组、阳性药组的趋势,p>0.05。各组平均值比较显示:三期组有高于模型组、一期组、阳性药组的趋势,p>0.05。三期组有高于模型组的趋势,p>0.05。术后6-28天:三期组有高于模型组的趋势,p>0.05。3.2.5各组纤维骨痂TGF-β₁mRNA表达各组间MOD值的比较显示:术后14天:阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组,p<0.01;阳性药组显著高于一期组,p<0.05;三期组显著高于一期组,p<0.05。术后28天:一期组显著高于模型组,p<0.05;阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于一期组,p<0.01。各组平均值比较显示:一期组极显著高于模型组,p<0.01;阳性药组极显著高于模型组,p<0.01;三期组极显著高于模型组,p<0.01。中药组显著高于模型组,p<0.05。术后14天:三期组极显著高于模型组,p<0.01;阳性药组极显著高于模型组,p<0.01。术后28天:三期组、阳性药组、一期组极显著高于模型组,p<0.01。4结论（1）中药能促进骨折愈合过程中不同组织FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达,说明中药干预有促进骨折愈合的作用。（2）骨折三期治疗在不同组织表达都有促进FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达作用。这是骨折三期治疗促进骨折愈合的作用机制之一。（3）中药对骨折愈合不同阶段各种组织的FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达有不同的作用,根据骨折愈合不同阶段施以相应治则的分期治疗较不分期治疗对于FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达的促进作用更明显,显示中医骨折分期治疗是必要的。（4）中医骨折三期治则分别针对骨折愈合不同时期的病理变化,采用相应的中药可以促进相应部位的FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达,是比较科学的骨折分期治疗方法。5创新点（1）发现骨折愈合过程中不同组织中FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达特征目前对于骨折愈合过程中FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达的研究,均是研究骨痂中FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA的定量变化。揭示不同组织FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达特征的研究,未见报道。（2）阐明骨折三期治疗对骨折愈合过程中FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达的作用目前仅对VEGFmRNA和BMP-2mRNA在骨折愈合过程中有过研究,通过研究骨折愈合过程中FGF-2mRNA,TGF-β₁mRNA表达变化情况,揭示骨折三期治则促进骨折愈合的作用机制,未见报道。