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目的:胶质瘤是最常见的头颈部恶性肿瘤,传统治疗方法是手术治疗,放化疗辅助。有很多因素影响胶质瘤治疗和预后效果:首先,不能通过血脑屏障的药物影响化疗效果;其次,有关中枢神经系统化疗药的抗瘤谱尚未完全掌握,导致难以选择合适的药物;再有在治疗中产生耐药性,也是胶质瘤无法根据不同肿瘤类型选择敏感性药物的原因之一。TGF-β家族影响细胞的增殖与分化,正常细胞和癌细胞中都表现出重要作用。GDF15作为TGF-β家族的一员,与肿瘤的发生发展密切相关。目前已有关于GDF15影响肿瘤增殖能力和侵袭能力的相关研究,尚无GDF15有关胶质瘤耐药的相关研究,且机制尚不清楚。本研究通过构建shRNA慢病毒表达载体,包装慢病毒,感染胶质瘤U373和U87细胞,并进一步建立GDF15稳定低表达胶质瘤细胞株,观察GDF15低表达是否及如何影响胶质瘤细胞的化疗敏感性,并讨论其相关机制。方法:1.GDF15低表达shRNA慢病毒载体的构建,建立GDF15稳定低表达的U373和U87细胞株针对GDF15目的基因序列,设计2条RNA干扰靶点序列,合成单链DNA Oligo,通过退火形成双链DNA Oligo,经过连接载体GV248和转化,菌液鉴定阳性克隆结果,最后包装病毒,收取集病毒液。用提取好的病毒液GV248-GDF15-RNAi(1)和GV248-GDF15-RNAi(2)感染胶质瘤U373细胞,感染后24到72 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,通过Western Blot技术检测感染GV248-GDF15-RNAi(1)和GV248-GDF15-RNAi(2)细胞GDF15蛋白的表达情况。筛选出抑制效率较高的干扰序列,其病毒液感染胶质瘤U373和U87细胞,再用嘌呤霉素分别筛选出GDF15稳定低表达胶质瘤U373和U87细胞株。2.检测GDF15低表达对U373细胞化疗敏感性的影响探讨GDF15低表达后,U373细胞对肿瘤化疗药物的敏感性,实验组U373-GDF15-RNAi和阴性对照组U373-NC-RNAi,分别用VM-26(替尼泊苷)和DDP(顺铂)两种化疗药物处理。VM-26组药物终浓度为:0.1、0.5、2.5和12.5μg/mL;DDP组药物终梯度浓度为:0.08、0.4、2和10μg/m L。两种药物作用细胞48h后,mtt法检测药物的细胞毒作用,hoechst/pi双染检测给药后细胞凋亡形态学变化,westernblot检测bcl-2、bcl-xl、p53和caspase-3表达。3.检测gdf15低表达对u87细胞化疗敏感性的影响探讨gdf15低表达后,u87细胞对肿瘤化疗药物的敏感性,实验组u87-gdf15-rnai和阴性对照组u87-nc-rnai,分别用vm-26(替尼泊苷)和ddp(顺铂)两种化疗药物处理。vm-26组药物终浓度为:0.1、0.5、2.5和12.5μg/ml;ddp组药物终梯度浓度为:0.08、0.4、2和10μg/ml。两种药物作用细胞48h后,mtt法检测药物的细胞毒作用,hoechst/pi双染检测给药后细胞凋亡形态学变化,westernblot检测bcl-2、bcl-xl、p53和caspase-3表达。结果:1.成功构建gdf15低表达shrna慢病毒,建立gdf15稳定低表达胶质瘤细胞株构建关于gdf15基因干扰序列的shrna慢病毒,用筛选出干扰作用明显的序列gv248-gdf15-rnai(1),感染胶质瘤u373和u87细胞。westernblot结果显示,gdf15蛋白表达明显降低,成功建立gdf15稳定低表达的胶质瘤u373和u87细胞株。2.gdf15低表达对u373细胞化疗敏感性的影响vm-26和ddp处理u373细胞48h后,随药物浓度增加,细胞的存活率显著下降,与阴性对照u373-nc-rnai细胞相比,实验组u373-gdf15-rnai细胞在vm-26和ddp各种浓度下的存活率都显著较高;hoechst/pi双染结果显示,经药物处理,细胞核发生凝聚固缩,出现凋亡,但在同一药物相同给药浓度下,u373-gdf15-rnai组凋亡细胞所占比例明显小于u373-nc-rnai组凋亡细胞所占比例;westernblot结果显示,随着药物组浓度的增加,每种细胞的bcl-2和bcl-xl蛋白表达逐渐减少,p53和caspase-3蛋白表达逐渐增多。阴性对照lv-rnai细胞相比,同一药物相同给药浓度下实验组u373-gdf15-rnai组细胞bcl-2和bcl-xl蛋白表达量显著上升,而p53和caspase-3蛋白表达显著减少。3.gdf15低表达对u87细胞化疗敏感性的影响vm-26和ddp处理u87细胞48h后,随药物浓度增加,细胞的存活率显著下降,与阴性对照u87-nc-rnai细胞相比,实验组u87-gdf15-rnai细胞在vm-26和ddp各种浓度下的存活率都显著较高;hoechst/pi双染结果显示,经药物处理,细胞核发生凝聚固缩,出现凋亡,但在同一药物相同给药浓度下,U87-GDF15-RNAi组凋亡细胞所占比例明显小于U87-NC-RNAi组凋亡细胞所占比例;Western Blot结果显示,随着药物浓度的增加,细胞Bcl-2和Bcl-x L蛋白表达逐渐减少,p53和Caspase-3蛋白表达逐渐增多。阴性对照LV-NC-RNAi细胞相比,同一药物相同给药浓度下实验组U87-GDF15-RNAi细胞Bcl-2和Bcl-x L蛋白表达量显著上升,而p53和Caspase-3蛋白表达显著减少。结论:1.成功构建两种GDF15低表达shRNA慢病毒载体,并建立GDF15稳定低表达的U373和U87细胞株。2.GDF15低表达胶质瘤细胞能降低对化疗药物的敏感性,提高细胞存活率。3.GDF15低表达可以减少细胞凋亡,减轻化疗药物所致细胞核固缩等。4.GDF15低表达的胶质瘤U373和U87细胞,用化疗药物处理后,通过增加Bcl-2和Bcl-x L蛋白表达,同时减少p53和Caspase-3蛋白表达来诱导胶质瘤U373和U87细胞的化疗耐药。