实验背景及目的骨肉瘤(Osteosarcoma)亦称为成骨肉瘤,是高度恶性的原发性骨肿瘤,发病年龄在10-30岁之间,发病率居原发性恶性肿瘤之首。骨肉瘤的病程进展很快,在临床确诊病例中,80%的患者已发现有血行远隔转移。经过手术前动脉灌注化疗结合术后化疗,能够让多数患者避免截肢,明显提高了生存质量,预后有所改善,生存率有了明显提高。但是,骨肉瘤较高的侵袭转移能力以及对化疗药物的耐药,使得部分患者在接受了规范手术和化疗以后,仍然出现早期复发或早期转移。p27是调节细胞周期G1/S期的一种抑制因子,在维持细胞周期顺利进行中起关键性作用。体外实验研究发现,作为一个细胞周期抑制因子,p27不仅能抑制正常的血管内皮细胞增殖和迁移,也能诱导细胞凋亡。实验发现p27在体内能够抑制各种原发性肿瘤和转移性肿瘤的生长,p27基因的缺失是导致骨肉瘤的发生和病变进展的重要原因之一。根据报道,p27基因在人类骨肉瘤移植瘤裸鼠模型中,可以改善肿瘤裸鼠的预后,缓解症状,延长生存时间。中药“片仔癀”具有清热解毒,减少肿胀和软坚散结的功效,能够促进血液循环,消除血瘀,临床多用于消化系统肿瘤的治疗以及防治肿瘤化疗过程中的肝损害。有研究证实片仔癀对骨肉瘤移植瘤细胞具有诱导凋亡的作用。文献报告人类骨肉瘤细胞株MG63、 Saos-2等,经细胞培养技术移植于裸鼠骨髓腔内可形成骨肉瘤病理模型；而腺相关病毒可作为p27基因载体,并在动物体内表达p27蛋白,且具有相关生物活性。因此,本实验选取人类骨肉瘤Saos-2细胞株,建立裸鼠原位移植瘤模型,使用腺相关病毒作为p27基因载体,分别观察和比较p27基因、中药“片仔癀”以及两者联合应用对人类骨肉瘤生长的抑制作用,为以后骨肉瘤的基因治疗以及中药治疗提供实验依据。实验材料1、细胞、药物及试剂：人类骨肉瘤Saos-2细胞系,购于上海超研生物科技有限公司；片仔癀(主要成分含有麝香、牛黄、三七、蛇胆等),购于漳州片仔癀制药有限公司(生产批号：H.M.L.N.Z20080011);转染raav-p27的重组腺相关病毒溶液、空载体重组腺相关病毒(rAAV-MCS)悬液,购于西安华光生物工程公司；胎牛血清(FBS),购于HyClone公司(NE, USA), p27抗体,购于上海宝特生命科学发展有限公司；酶链亲和素-生物素(SABC)试剂盒,购于上海复中生物技术有限公司；兔抗β-actin抗体,美国Santa Cruze公司产品,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,美国Santa Cruze公司产品；ECL试剂盒,美国Santa Cruze公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒,美国Bio-Rad公司产品。2、主要仪器设备：血红细胞计数器(上海实验室仪器有限公司,中国);半干转印仪(Semidry Transfer system,美国Bio-Rad公司)；紫外凝胶自动成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司,中国)实验方法1、实验动物：BALB/C裸鼠30只,SPF级无特殊病原体,3-4周龄,体重15-20g,雌雄不限,规格为：CAnN.Cg-Foxn1nu/Cr1VR,购自上海宝特生命科学发展有限公司。饲养条件：恒温25-27℃,湿度45%-50%,半屏障系统环境下饲养,食用灭菌处理过的饲料、水,高效过滤系统处理过的空气,每小时换气10-15次,一天10小时照明,14小时在无照明黑暗条件下饲养。2、人类骨肉瘤Saos-2细胞株的细胞培养：细胞培养液的制备：采用Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640培养液,加入10%标准胎牛血清,2mmol/L-谷氨酰铵,100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素,过滤和消毒后,4℃储存备用。将装有人类骨肉瘤Saos-2细胞株的冻存管从液氮罐里取出,解冻、洗涤、离心处理后,将细胞悬液转移至10ml培养皿中,放置在37℃,5%CO2培养箱中过夜。当细胞生长至相对密度80%左右时,加入胰酶消化液,在37℃,5%的CO2培养箱里消化2-3分钟,然后加入2ml细胞培养液终止细胞消化,此时,在显微镜下可观察到大多数的游离圆形细胞。用吸管将细胞充分搅匀后,静置。离心弃上清,加入5ml细胞培养液,吹打均匀。用细胞计数器计数后备用。3、在无菌条件下,用4%水合氯醛(10μ L/g)将裸鼠麻醉。然后用1ml规格注射器4号针头吸取0.1ml细胞悬液(1×107个细胞／注射器)注射到裸鼠右侧腋窝皮下,每次注射两只裸鼠。2-4周后,待观察到裸鼠皮下移植瘤生长至1.0cm×1.0cm×1.5cm大小后,处死裸鼠,在无菌条件下取除骨肉瘤瘤体组织。将得到的腋窝肿瘤组织处理成0.1cm×0.1cm×0.1cm大小后再移植在新的裸鼠右后腿上端胫骨骨髓腔内,然后将裸鼠放回饲养笼,观察肿瘤的生长。此时,人类骨肉瘤Saos-2细胞株裸鼠原位模型建立成功。肿瘤细胞接种后,动物生长状况良好,在接种Saos-2细胞株5天之后,可见肿瘤组织在裸鼠皮下已随时间增长。接种六周后,没有出现动物死亡,肿瘤相对体积增长率为92.7%。4、实验分组及处理：肿瘤细胞接种一周后,待肿瘤生长至0.8cm时,挑选30只肿瘤体积相近的裸鼠按随机数字表随机分为5组,每组6只：空白对照组,用100μLPBS注射肿瘤部位,3天1次；空载体对照组,用100μL多克隆位点重组腺相关病毒(rAAV-MCS)悬液注射肿瘤部位,空载体病毒溶液浓度1×1011/L,3天1次；片仔癀药物组,在肿瘤形成后,按0.01ml/g剂量,每天早晚各喂食给药一次,共两次给药。p27基因组,用100μL raav-p27病毒溶液注射,病毒溶液浓度1×1011/L注射肿瘤部位,3天1次。5.联合治疗组,用100μL raav-p27病毒溶液注射肿瘤部位,3天1次,同时喂食片仔癀溶液,一天早晚两次给药。在裸鼠接种之后,观察并记录它们的精神状态,体重,食欲、粪便和尿液。如果实验中发现裸鼠死亡,解剖并分析死亡原因。肿瘤细胞接种6周之后,用颈椎脱臼法将所有裸鼠处死。剥离肿瘤组织,称重并记录肿瘤重量,计算肿瘤生长抑制率,计算公式为：(对照组瘤重-实验组瘤重)／对照组瘤重×100%。在动物模型建立之后,用游标卡尺测量每组裸鼠的第1,4,8,12,16,18和22天肿瘤的最大和最小直径,并应用Steel公式V=1/2ab2计算体积,其中a,b分别是肿瘤的最大和最小直径。5、免疫组织化学染色：将肿瘤组织用福尔马林固定,石蜡包埋后进行免疫组织化学方法(IHC)染色。使用鼠抗p27抗体(一抗)及碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG(二抗),运用链霉亲和素-生物素复合物(SABC法),并运用双重染色法检测p27的蛋白表达。使用光学显微镜观察,在放大10倍的视野内统计阳性细胞表达率,来判断p27的表达情况。6、蛋白质印迹分析：从肿瘤组织细胞中提取蛋白,然后用抗p27兔单抗和兔抗β-actin内参抗体来进行免疫印迹实验(Western-Blot)。经ECL化学发光底物曝光后,用实验室图像分析软件计算蛋白含量。7、统计分析：采用SPSS10.0分析软件程序来进行统计分析。数据采用平均值±标准差(X±S),与对比组进行单向方差分析和LSD分析。结果1、动物模型的症状观察：及肿瘤细胞移植到裸鼠体内7周之后,p27基因组,联合治疗组以及片仔癀药物组所有的裸鼠都存活下来,空白对照组和空载体对照组各有1只死亡。空白对照组和空载体对照组的裸鼠肿瘤体积增长非常明显,且两者之间没有显著差异,裸鼠的精神状态和食欲下降,尿液颜色偏暗,粪便偏干,体重下降。片仔癀药物组的裸鼠肿瘤增长相对较缓慢,精神状态良好,食欲正常,体重变化不大,粪便和尿液的颜色和性状均正常。p27基因组的裸鼠肿瘤增长同样较慢,精神状态一般,食欲略有下降,体重随着肿瘤体积增加有所增长,但体型偏瘦,偶尔还存在腹泻。联合治疗组的肿瘤生长抑制明显,裸鼠的精神状态很好,饮食、粪便和尿液正常,没有腹泻现象,但体重略有下降。2、肿瘤生长情况和抑制率统计：空白对照组与空载体对照组的肿瘤体积相近(P>0.05)。在第8,12,16,18和22天记录的肿瘤体比较中,p27基因组和片仔癀药物组与空白对照组相比,呈明显下降(P<0.05)；联合治疗组与片仔癀药物组或者p27基因组相比,也是明显减少(P<0.05)。在肿瘤平均重量比较上,片仔癀药物组和p27基因组比空白对照组轻(P<0.05)。联合治疗组比片仔癀药物组或者p27基因组也要轻(P<0.05)。因此,可判断在肿瘤抑制率上,片仔癀药物组和p27基因组比空白对照组高(P<0.05)。联合治疗组比片仔癀药物组或者p27基因组同样也高(P<0.05)。3、p27蛋白表达情况：经染色后的p27蛋白阳性细胞,可在细胞核里观察到棕黄色颗粒。在p27蛋白阳性率统计上,p27基因组比空白对照组有显著提高(P<0.05),联合治疗组比p27基因组或者片仔癀药物组也有明显提高(P<0.05)。免疫印迹试验显示在p27基因表达量比较上,p27基因组比空白对照组高(P<0.05),联合治疗组比p27基因组或者片仔癀高(P<0.05)结论1、Saos-2人类骨肉瘤细胞株经培养传代后可移植裸鼠获得肿瘤原位生长的动物模型。2、腺相关病毒作为基因载体对肿瘤生长无影响,转染p27基因的腺相关病毒可增加肿瘤组织内p27蛋白的表达。3、p27基因、片仔癀均有抑制骨肉瘤生长的作用,二者联合应用时对肿瘤生长的抑制作用明显增强。意义证实了p27重组腺相关病毒可用于骨肉瘤的研究和治疗,p27基因与中药片仔癀联合应用对骨肉瘤的抑制有协同作用。初步探讨了腺相关病毒作为基因载体用于肿瘤基因治疗的可能性,在骨肉瘤的临床治疗方面,为p27基因联合中药片仔癀的疗效研究,进一步奠定了理论基础。